鄒振平，王婷婷，袁通闊，樓瑩瑩，王一東

（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

一種基于細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)的羊肚菌單孢子菌種分離方法*

鄒振平，王婷婷，袁通闊，樓瑩瑩，王一東**

（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

為了獲取羊肚菌（Morchella esculenta）單孢子菌種，利用經(jīng)無(wú)菌處理的羊肚菌孢子懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后稀釋至每100微升含2個(gè)、1個(gè)、0.5個(gè)孢子，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)孔中，鏡檢觀察各孔中的孢子數(shù)并標(biāo)記出含單個(gè)孢子的培養(yǎng)孔。室溫下培養(yǎng)，待單孢子孔中孢子萌發(fā)的菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底部邊緣時(shí)，將菌絲轉(zhuǎn)移至PDA平板中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)得到的菌絲進(jìn)行ELISA鑒定，確定分離得到羊肚菌單孢子菌種，然后將菌種進(jìn)行編號(hào)，擴(kuò)大培養(yǎng)并保存。利用該方法分離得到3株羊肚菌單孢子菌種，分別編號(hào)為L(zhǎng)G－01、LG－02、LG－03。

羊肚菌；單孢子菌種；細(xì)胞計(jì)數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)

羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pers.]是一種以美味著稱的珍稀食用菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值[1]。目前羊肚菌還無(wú)法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模人工栽培，價(jià)格一直居高不下，這與人們對(duì)羊肚菌的生活史并不十分了解有關(guān)[2－3]。為加深人們對(duì)羊肚菌生活史的了解，開展人工栽培實(shí)踐，迫切需要在羊肚菌單孢子菌種的分離、單孢子菌絲的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，以及能否出菇方面展開研究。與傳統(tǒng)的孢子菌種分離（如：劃線分離、稀釋涂布、顯微鏡下單孢直接挑取等）方法不同[4－5]，本文介紹一種借鑒動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中單克隆細(xì)胞操作，進(jìn)而演化的羊肚菌單孢子菌種分離方法[6]，該方法具有操作簡(jiǎn)便、易于觀察的特點(diǎn)，結(jié)合免疫學(xué)的ELISA鑒定[7]，可以保證分離菌種的可靠性。目前還未見其相關(guān)的研究報(bào)道。該方法為羊肚菌生活史研究及羊肚菌人工栽培的開展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和羊肚菌孢子

羊肚菌（Morchella esculenta）菌株（51589號(hào)），購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

黑木耳（Auricularia auricula） 菌種，購(gòu)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所。

野生羊肚菌子實(shí)體于2006年5月中旬采自吉林省吉林市豐滿區(qū)旺起鎮(zhèn)，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境下收集吸附于打印紙上的子實(shí)體自然彈射孢子，4℃保存于冰箱。

1.1.2 主要試劑

孢子洗脫液：含雙抗（青霉素100 IU·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1）、0.05%Toween-20無(wú)菌水溶液；孢子萌發(fā)液：水1 000 mL、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g，121℃滅菌20 min；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨3 g、瓊脂粉20 g，水1 000 mL，121℃滅菌20 min；PDB培養(yǎng)基：不添加瓊脂粉的PDA液體培養(yǎng)基；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+ L），購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB，Sigma公司產(chǎn)品；抗羊肚菌單克隆抗體（C6A8株腹水）、抗羊肚菌多克隆抗體（兔高免血清），由長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備并保存[8]。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.3 主要材料、儀器及設(shè)備

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，康寧公司；XB.K.25細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；超凈工作臺(tái)；80-2B飛鴿牌離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；XD30倒置顯微鏡，寧波舜宇公司；HZQ-QX型全溫震蕩器，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；MDF-192型低溫冰箱，SANYO公司；ELx800TM酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；微量移液器；高壓滅菌鍋等。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌孢子懸液制備及孢子計(jì)數(shù)

在超凈工作臺(tái)中，剪取約2 cm×2 cm載有羊肚菌孢子的打印紙于小燒杯中，加入15 mL孢子洗脫液并用鑷子輕輕攪動(dòng)紙片洗下孢子，制成孢子懸液。將孢子懸液移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；加入適量孢子萌發(fā)液吹打重懸后，相同轉(zhuǎn)速離心，重復(fù)3次上述離心操作。加入10 mL孢子萌發(fā)液吹打重懸，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在100×顯微鏡下進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。

1.2.2 有限稀釋法獲得羊肚菌單孢子及其萌發(fā)情況觀察

根據(jù)計(jì)數(shù)得出孢子濃度，用孢子萌發(fā)液做適當(dāng)倍數(shù)的稀釋，用無(wú)菌微量移液器吸取含130個(gè)孢子體積的孢子懸液，移入孢子萌發(fā)液中并使終體積為6.5 mL。此時(shí)的孢子懸液濃度為20個(gè)·mL-1，100 μL·孔-1加入細(xì)胞培養(yǎng)板A、B、C三行；余下2.9 mL孢子懸液補(bǔ)加2.9 mL孢子萌發(fā)液，此時(shí)的孢子懸液濃度為10個(gè)·mL-1，100 μL·孔-1加入D、E、F三行；余下2.2 mL孢子懸液補(bǔ)加2.2 mL孢子萌發(fā)液，此時(shí)的孢子懸液濃度為5個(gè)·mL-1，100 μL·孔-1加入G、H兩行。在100×倒置顯微鏡下觀察加入孢子的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，記錄各孔中所含的孢子數(shù)，并對(duì)含有單個(gè)孢子的培養(yǎng)孔進(jìn)行標(biāo)記，室溫下培養(yǎng)，定時(shí)觀察孢子萌發(fā)情況。記錄孢子的萌發(fā)總數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.3 羊肚菌單孢子菌種的獲取及鑒定

待含單個(gè)孢子的培養(yǎng)孔中萌發(fā)的菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底部邊緣時(shí)，在無(wú)菌條件下將其轉(zhuǎn)接到PDA平板中培養(yǎng)并編號(hào)，初步得到了羊肚菌單孢子分離菌種。

菌種鑒定：待上述平板中的菌絲生長(zhǎng)后，按編號(hào)無(wú)菌挑取適量菌絲接種至PDB培養(yǎng)基中，22℃、120 r·min-1培養(yǎng)，4 d后收集菌絲球，將收集的菌絲球放入研缽中，加入適量的海沙及pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）充分研磨破碎，收集研磨液3 000 r·min-1離心20 min，取上清10 000 r·min-1離心5 min，所得上清即為待測(cè)抗原原液。用同樣的方法制備、處理標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原（51589號(hào)）、陰性抗原（木耳菌絲），對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行ELISA夾心法檢測(cè)，以檢測(cè)樣品的OD值與陰性樣本OD值的比值（P/N）大于等于2.1，判定為羊肚菌的菌絲，檢測(cè)過(guò)程參照文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子計(jì)數(shù)及懸液稀釋結(jié)果

取少量無(wú)菌處理后的孢子懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，孢子懸液濃度為4×104個(gè)·mL-1，用無(wú)菌微量移液器取出100 μL孢子懸液于10 mL孢子萌發(fā)液中吹打均勻（稀釋100倍），從中取出325 μL懸液并補(bǔ)充孢子萌發(fā)液至6.5 mL，得到濃度為20個(gè)·mL-1的孢子懸液。

2.2 孢子分離結(jié)果與孢子萌發(fā)情況

鏡檢96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，各培養(yǎng)孔中孢子分布結(jié)果見表1。

表1 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的孢子分布Tab.1 Distribute of the spores in 96-well cell culture plate

3 d～5 d時(shí)陸續(xù)觀察到10個(gè)孢子萌發(fā)，5 d后則未發(fā)現(xiàn)有孢子繼續(xù)萌發(fā)，孢子萌發(fā)率為12.5%（萌發(fā)率為萌發(fā)的孢子數(shù)除以孢子總數(shù)乘以100%），10個(gè)萌發(fā)的孢子中，D6、E6、G9萌發(fā)前即為分離得到的單個(gè)孢子，待菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底部邊緣時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至PDA平板中培養(yǎng)，編號(hào)LG-01、LG-02、 LG-03。為了保證單孢子分離的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)舍棄了非單孢子培養(yǎng)孔中孢子萌發(fā)的菌絲。

2.3 ELISA夾心法鑒定羊肚菌單孢子菌株及分離結(jié)果

利用ELISA夾心法對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行檢測(cè)，以P/ N比≥2.1判定為陽(yáng)性，結(jié)果見表2。

表2 ELISA夾心法檢測(cè)分離菌株結(jié)果Tab.2 Results of isolated strains detection by sandwich ELISA

由表2可以看出，以標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原（51589號(hào)）為陽(yáng)性對(duì)照，木耳菌絲為陰性對(duì)照，PBS緩沖液為試劑空白，進(jìn)行了多次的ELISA夾心法檢測(cè)。結(jié)果顯示LG-01、LG-02、LG-03均表現(xiàn)為陽(yáng)性（以P/N大于2.1為陽(yáng)性），確定為羊肚菌菌絲，并對(duì)分離得到的3株羊肚菌單孢子菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保存。

3 討論

傳統(tǒng)的分離羊肚菌單孢子菌種的劃線法、稀釋涂布法，具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但其分離的是肉眼可見的單菌落，而無(wú)法保證是單孢子萌發(fā)的菌落，可靠性較差；顯微鏡下的單孢子直接挑取法雖分離準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)專門訓(xùn)練，且在挑取過(guò)程中易污染。本文提出的羊肚菌單孢子菌種分離方法則具有操作便捷、不易污染的特點(diǎn)，并可在顯微鏡下觀察到單孢子萌發(fā)，配合ELISA方法鑒定分離的菌種，為羊肚菌單孢子菌種分離提供了準(zhǔn)確性與可靠性雙重保障。此種方法進(jìn)行羊肚菌單孢子分離操作的關(guān)鍵在于對(duì)懸液孢子濃度的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)及稀釋。

本實(shí)驗(yàn)使用的羊肚菌孢子的萌發(fā)率相對(duì)于新鮮羊肚菌孢子的萌發(fā)率較低[9]，并且在萌發(fā)時(shí)間方面存在差異，推測(cè)原因或與孢子長(zhǎng)時(shí)間4℃保存有關(guān)（保存10年）?？紤]到常用的乙醇做滅菌處理或許會(huì)對(duì)孢子造成傷害，在本試驗(yàn)中我們使用了較溫和的低濃度青霉素與鏈霉素（雙抗）處理孢子，效果較為理想。

通過(guò)對(duì)羊肚菌單孢子菌種的分離、單孢子菌絲的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)發(fā)育以及能否出菇進(jìn)行了研究，將有助于人們了解羊肚菌生活史，而對(duì)羊肚菌生活史了解的深入程度將直接影響到人工栽培實(shí)踐的成敗。同時(shí)，單孢子菌種分離技術(shù)也是食用菌雜交育種的前提之一[10]。本文介紹的這種便捷的羊肚菌單孢子分離方法，或許能為上述目的實(shí)現(xiàn)提供一定的支撐。

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A Separation Method for Morchella Monospore Strains Based on Cell Count Technology

ZOU Zhen-ping,WANG Ting-ting,YUAN Tong-kuo,LOU Ying-ying,WANG Yi-dong
（Changchun University of Science and Technology,School of Life Science and Technology,Changchun 130022,China）

In order to obtain monospore strains of Morchella esculenta,M.esculenta spore suspension processed by sterile were diluted to 2,1,0.5 spores per 100 μL after it counted by cell counting plate,which were added to 96－well cell culture plate respectively,and the spore number were observed using microscope and the well with a single spore were marked.The spore were cultured at room temperature,when the spore germination hyphae grew to culture wells,edge in the well with single spore,the hyphae was moved to the PDA plates,which were identified by ELISA to ensure that the Morchella strains were isolated from single spores,then the monospore strains were numbered,expanded and saved.Using this method,three M.esculenta single spore strains were isolated,named LG－01,LG－02 and LG－03.

Morchella;monospore strains;cell count;enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

S646.9

A

1003-8310（2016）05-0006-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.05.002

長(zhǎng)春理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2015S054、2016S093）；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字[2016]第384號(hào)）。

鄒振平（1995－），男，在讀本科，主要研究方向?yàn)槭秤镁鷮?shí)驗(yàn)技術(shù)。E－mail:zouzp82465＠163.com

**通信作者：王一東（1962－），男，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品與衛(wèi)生檢驗(yàn)研究。E－mail:wyd＠cust.edu.cn

2016－07－10