常秀娟，范麒如，王紅梅，周 軍，李 娜，王振中，蕭 偉＊＊

(1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001)

熱毒寧拆方對(duì)RAW 264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響＊

常秀娟1,2，范麒如1,2，王紅梅1,2，周 軍1,2，李 娜1,2，王振中1,2，蕭 偉1,2＊＊

(1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001)

目的：本研究主要觀察熱毒寧及其拆方對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥模型分泌促炎因子的影響，探討熱毒寧及其拆方的抗炎作用。方法：體外培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，熱毒寧及 其拆方作用于未經(jīng)刺激的RAW 264.7細(xì)胞及LPS（1 mg·L-1）刺激后的RAW 264.7細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、LPS模型組、給藥組組，采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同相對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖活力，硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）的含量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的分泌量。結(jié)果：與LPS模型組比較，各提取物組，NO、TNF-α、PGE2的表達(dá)明顯降低；3種不同藥材提取物之間比較，青蒿對(duì)PGE2的抑制作用較為明顯，梔子對(duì)TNF-α的抑制較為明顯，金銀花對(duì)NO的抑制作用較為明顯，且藥材提取物之間有協(xié)同作用，熱毒寧組合對(duì)PGE2、TNF-α、NO的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論：青蒿、梔子、金銀花提取物均能明顯拮抗LPS所致的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)；不同提取物組合的抗炎作用有差異，熱毒寧組合的抗炎作用最強(qiáng)。

熱毒寧注射液 RAW 264.7 腫瘤壞死因子α 前列腺素E2一氧化氮

熱毒寧注射液 處方源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，方內(nèi)含青蒿、金銀花、梔子。臨床主要用于治療急性上呼吸道感染（外感風(fēng)熱證）所致的高熱、微惡風(fēng)寒、頭身痛、咳嗽等癥，并取得了較好的療效[1，2]。在以往的研究中，我們已發(fā)現(xiàn)熱毒寧注射液具有抑制病毒作用，解熱作用[3-5]。本文試用混料均勻設(shè)計(jì)法 熱毒寧方進(jìn)行組方配比研究，通過體外藥效實(shí)驗(yàn)，對(duì)復(fù)方中的藥物協(xié)同關(guān)系進(jìn)行科學(xué)的驗(yàn)證。

1 材料及方法

1.1 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑有：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：20140312）；LPS、MTT（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：114M4009）；PGE2（美國(guó)Ebioscience公司，批號(hào)：97541005）、TNF-α （ELISA法）試劑盒（美國(guó)R&D公司，批號(hào)：332360），NO試劑盒（Griess法）（南通碧云天公司）；木犀草素（上海永恒生物科技有限公司，批號(hào)：20110112）；青蒿、梔子、金銀花（連云港康濟(jì)大藥房）。

1.2 儀器

371型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；LT-9004+型潔凈工作臺(tái)（蘇州艾克林凈化設(shè)備有限公司）；CKX41SF型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Invitrogen公司）；Floxtstation 3鈣流工作站（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.3 熱毒寧及其拆方提取物

青蒿、梔子、金銀花3味藥材均為2010版《中國(guó)藥典》收載品種。參照文獻(xiàn)[6]， 用95%乙醇分別提取青蒿、梔子、金銀花藥 材2次，藥渣加水提取2次，合并醇提液、水提液后 以12 000 r·min-1高速離心30 min，取上清液超濾2次（相對(duì)分子質(zhì)量截留值為100 000和5 000），收集超濾液，減壓濃縮后，金銀花為1.43 g·g-1生藥，梔子為1.04 g·g-1生藥，青蒿為0.195 g·g-1生藥，按照注射液生藥比例混合，4℃冰箱冷藏備用。分組方法：①熱毒寧組（青蒿∶梔子∶金銀花為0.48∶0.29∶0.23組成）；②青蒿組；③梔子組；④金銀花組；⑤青蒿+梔子組（青蒿∶梔子為0.68∶0.32）；⑥青蒿+金銀花組（青蒿∶金銀花為0.63∶0.37）；⑦梔子+金銀花組（梔子∶金銀花為0.56∶0.44）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含 10%胎牛血清，100 mg·L-1鏈霉素，100 U·mL-1青霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液于37℃ CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代，細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈半貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)熱毒寧及拆方提取物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞增殖能力的影響

RAW 264.7 細(xì)胞按2×105接種于96孔板中，培養(yǎng)系體積控制在200 μL。實(shí)驗(yàn)分為7組：正常細(xì)胞對(duì)照組、熱毒寧組、青蒿組、梔子組、金銀花組、青蒿+梔子組、青蒿+金銀花組和梔子+金銀花組，生藥濃度依次為1、2、4、8、16 g·mL-1，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，孵育20 h，然后每孔加入20 μL的MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)孵育4 h；吸取培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，1 500 r·min-1搖床孵育5 min，在490 nm處測(cè)量吸光度（A）值。細(xì)胞增殖率=（A受試孔-A對(duì)照孔）/（A對(duì)照孔）×100%。

2.3 ELISA法檢測(cè)熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α、PGE2的影響；Griess法測(cè)定提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響

細(xì)胞以2×105接種到96孔板培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分為8組：正常細(xì)胞對(duì)照組、LPS組、熱毒寧組、青蒿組、梔子組、金銀花組、青蒿+梔子組、青蒿+金銀花組、梔子+金銀花組，生藥濃度均為8 g·mL-1，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥完畢后將96孔板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。正常組每孔加入5 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，其余組每孔加入5 μL的LPS（終濃度為1 μg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)23 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明書檢測(cè)各細(xì)胞因子的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（），量反應(yīng)資料統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析檢驗(yàn)法，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 熱毒寧及拆方提取物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞增殖能力的影響

熱毒寧及拆方提取物在生藥濃度為1-8 g·mL-1時(shí)對(duì)RAW 264. 7細(xì)胞增殖無顯著影響，生藥濃度為16 g·mL-1時(shí)，作用24 h后，熱毒寧組的細(xì)胞存活率為98.42%，梔子組的存活率為95.39%，青蒿+梔子組的存活率為96.18%，梔子+金銀花組的存活率為97.94%，基本無細(xì)胞毒性。

3.2 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

空白組中TNF-α的質(zhì)量濃度為63.82 ng·L-1，經(jīng)1 mg·L-1的LPS刺激 6 h后，細(xì)胞釋放大量的TNF-α，此時(shí)上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度為3 051.81 ng·L-1，與空白組比較有顯著性差異，見表1。提取物各組可以明顯抑制 LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α，其中熱毒寧組顯著優(yōu)于單味藥材提取物，詳見表1。

3.3 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放PGE2的影響

提取物各組顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW 264.7細(xì)胞的PGE2的生成，與LPS組的PGE2濃度634.83 ng·L-1有顯著差異，且熱毒寧組顯著優(yōu)于單味藥材提取物及青蒿+金銀花組，詳見表2。

3.4 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響

空白組中檢測(cè)到的NO濃度非常低，僅為17.90 μmol·L-1，在1 mg·L-1的LPS刺激下，巨噬細(xì)胞釋放出大量的NO（253.76 μmol·L-1），表明LPS能明顯誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。與LPS組相比，各提取物組的NO含量明顯減少，且熱毒寧組顯著優(yōu)于單味藥材提取物，詳見表3。

表1 熱毒寧及拆方提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

表2 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放PGE2的影響

4 討論

巨噬細(xì)胞是具有異質(zhì)性的一類免疫細(xì)胞，在體內(nèi)外不同環(huán)境影響下可極化為不同表型參與生理、病理反應(yīng)。從激活方式上分為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（Classically Activated Macrophages，CAMs或M1）和選擇性激活的巨噬細(xì)胞（Alternatively Activated Macrophages，AAMs 或M2），M1型巨噬細(xì)胞可由IFN-γ或LPS單用或與其他細(xì)胞因子（如TNF-α）協(xié)同作用誘導(dǎo)活化[7-11]，LPS激活巨噬細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[12]，它是介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的主要啟動(dòng)因子，它可激活單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，引起細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ、ROS和NO等的合成和釋放，導(dǎo)致強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)最終造成細(xì)胞的凋亡和壞死[13-16]。IL-1β是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一種主要促炎因子，TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中最早和初級(jí)內(nèi)源性介質(zhì)，NO是一種生物信使分子，其生成依賴于誘導(dǎo)型iNOS，在抵抗入侵的細(xì)菌、真菌等微生物及在炎癥反應(yīng)中起著十分重要的作用[17，18]。

表3 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞釋放 NO 的影響

中藥復(fù)方是中醫(yī)藥理論的具體體現(xiàn)，將單味中藥或復(fù)方的活性物質(zhì)群按一定比例配伍組合，作用于多個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)多途徑的整合而發(fā)揮作用，多靶點(diǎn)協(xié)同作用是中藥復(fù)方作用形式已經(jīng)得到的共識(shí)[19]。本研究中，青蒿、金銀花、梔子單用對(duì) LPS刺激下RAW 264.7細(xì)胞炎性因子TNF-α、PGE2、NO分泌量的升高有明顯抑制作用，但顯著低于熱毒寧組；兩藥聯(lián)用后抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，部分組合物抑制作用與熱毒寧組相比無顯著差異；提示青金、青梔、金梔取物組合之間具有協(xié)同作用。兩藥相加起協(xié)同作用，能明顯增強(qiáng)藥物功效，中藥的協(xié)同作用，主要體現(xiàn)在配伍上，古藥籍中有過一些相關(guān)的論述，如《神農(nóng)本草經(jīng)》言：“藥有陰陽配合…有單行者，有相須者，有相使者，有相畏者，有相惡者，有相殺者。凡此七情，合而視之。當(dāng)用相須相使者，勿用相惡相反者”。《本草綱目》言：“藥有七情。獨(dú)行者，單表3 熱毒寧及拆方提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與熱毒寧組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。方不用輔也；相須者，同類不可離也；相使者，我之佐使也；相惡者，制彼 之毒也”。中藥的協(xié)同組合與藥物七情中的相須配伍有著異曲同工之妙[20]。本研究結(jié)果表明熱毒寧組方的抑制作用最強(qiáng)進(jìn)一步驗(yàn)證了其組方的合理性，進(jìn)一步加深了我們對(duì)熱毒寧注射液抗炎作用機(jī)制的理解。

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Effects of Reduning Injection and Its Decomposed Formulas on Inflammatory Cytokines in LPS-Stimulated RAW 264.7 Cells

Chang Xiujuan1,2, Fan Qiru1,2, Wang Hongmei1,2, Zhou Jun1,2, Li Na1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed to explore the regulation of proinflammatory factors through Reduning (RDN) injection and its decomposed formulas in lipopolysaccharides (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells, and discuss the anti-inflammatory effects of RDN injection and its decomposed formulas. The RAW 264.7 cells were culti vated in vitro, and stimulated by LPS (1 mg·L-1). Then, the cells were divided into the blank control group, LPS model group and RDN group. Effects on proliferation of RAW 264.7 cells were examined by MTT. The content of NOin the RAW 264.7 cells was detected by means of nitrate reductase. Concentrations of TNF-α and PGE2were quantified by ELISA. The results showed that NO, TNF-α and PGE2levels were decreas ed apparently in each extraction group when compared with the LPS model group. Three herbs in RDN presented different functions, while Artemisia apiacea down-regulated PGE2level, cape jasmine suppressed TNF-α expression and honeysuckle reduced NO level. In addition, all of them performed synergistic actions on anti-inflammatory effects. It was concluded that the extraction of Artemisia apiacea, cape jasmine and honeysuckle had obvious anti-inflammatory effect on the LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The functions varied by different combinations of three herbs. And the proportion of three herbs in RDN injection showed the strongest pharmacological action.

Reduning Injection, RAW 264.7 cells, TNF-α, PGE2, NO

10.11842/wst.2016.02.023

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-05-27

修回日期：2015-11-18

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十二五”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。