孫 蘭，周 軍，宗紹波，丁 崗，王振中，蕭 偉＊＊，寇俊萍

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210009；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司連云港 222001；3. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

桂枝茯苓膠囊及其成分組合物抗子宮收縮作用及其機(jī)制＊

孫 蘭1,2,3，周 軍2,3，宗紹波2,3，丁 崗2,3，王振中2,3，蕭 偉2,3＊＊，寇俊萍1＊＊

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210009；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司連云港 222001；3. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

目的：研究桂枝茯苓膠囊及成分組合物（14個(gè)成分）對(duì)子宮平滑肌收縮抑制作用及其機(jī)制。方法：采用 前列腺素F2α（Prostaglandin，PGF2α）誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮模型，檢測(cè)PGF2α誘導(dǎo)后的子宮組織p42/44絲裂原激活蛋白激酶（p42/44 MAPK）磷酸化及 間隙連接蛋白43 （Cx43）的表達(dá)水平，考察其抑制離體子宮平滑肌收縮可能的作用機(jī)制。結(jié)果：桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制子宮幅值50%濃度（IC50）分別為130.40、46.67 μg·mL-1；桂枝茯苓膠囊及其組合物能抑制PGF2α誘導(dǎo)的子宮組織p42/44MAPK磷酸化和Cx43水平升高。結(jié)論：桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制PGF2α誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮作用，其機(jī)制可能與降低子宮組織p42/44MAPK磷酸化水平、抑制Cx43蛋白表達(dá)增高有關(guān)。

桂枝茯苓膠囊 成分 前列腺素F2α子宮收縮

桂枝茯苓丸源于《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍五味藥材而成，有著2 000余年的臨床用藥歷史，是歷代醫(yī)家治療婦科疾病的首選良方。桂枝茯苓膠囊（Guizhi Fuling Capsule，GZFLC）是在桂枝茯苓丸基礎(chǔ)上利用現(xiàn)代工藝研制而成的新藥，具有活血化瘀、消癥之功效，臨床上主要用于治療原發(fā)性痛經(jīng)、子宮肌瘤、慢性盆腔炎包塊、 子宮內(nèi)膜異位癥等。文獻(xiàn)研究表明桂枝茯苓膠囊用于原發(fā)性痛經(jīng)具有較好療效[1-4]，對(duì)其他疾病引起的疼痛也有較好治療作用[5-7]。本文采用PGF2α誘導(dǎo)子宮收縮試驗(yàn)研究桂枝茯苓膠囊及其成分組合物（GZFLC中主要質(zhì)控成分）對(duì)子宮收縮的抑制作用并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，清潔級(jí)，雌性，體質(zhì)量18-20 g [揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004]。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠5只，溫度維持在20-25℃，相對(duì)濕度：40-70%，12 h光照周期，自由攝食和飲水。

1.2 藥物與試劑

桂枝茯苓膠囊，規(guī)格：0.31 g/粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：130816）；苯甲酸雌二醇注射液，規(guī)格：2 mL∶4 mg（寧波第二激素廠，批號(hào)：20131116）；生理鹽水，規(guī)格：100 mL/瓶（山東齊都藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：130908）；PGF2α（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBD9804V）；樂(lè)氏液，臨用時(shí)自配（NaCl 9.20 g，KCl 0.42 g，CaCl 20.24 g，NaHCO30.15 g，Glucose 1.00 g溶解于1 000 mL雙蒸水中即得，pH=7.4）；磷酸化p42/44絲裂原激活蛋白激 酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）（Thr202/Tyr204）E10單克隆抗體（德國(guó)CST公司，貨號(hào)：9101）；Cx43單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：A-1352）；β-Actin Antibody（德國(guó)CST公司，貨號(hào)：4967）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；沒(méi)食子酸、茯苓酸、苦杏仁苷、槲皮素、桂皮醛、芍藥苷、五沒(méi)食子酰葡萄糖、香豆素、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、白芍苷、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 儀器

電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；CENTRFNGE 5840R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；PowerLab 16/35生物信號(hào)采集系統(tǒng)，PL3508B6/25-220型8腔離體組織灌流系統(tǒng)，Chart 7數(shù)據(jù)分析軟件（澳大利亞AD Instruments公司）；Milli-Q Plus超純水裝置（美國(guó)Millipore 公司）；PHSJ-4FPH 指示計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；垂直電泳槽 （美國(guó)Bio-Rad公司）；轉(zhuǎn)移電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；全自動(dòng)數(shù)碼成像系統(tǒng)及分析系統(tǒng)（美國(guó)SYNGENE公司GeneGenius系統(tǒng)）。

2 方法

2.1 桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制小鼠離體子宮收縮量效關(guān)系考察

未孕小鼠頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇5 mg·kg-1，增加子宮的敏感性。于注射后24 h脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)∽訉m并清洗，用細(xì)線分別扎住子宮2端，分別固定于浴槽底部及張力換能器上。置于裝有20 mL樂(lè)氏液恒溫浴槽中，溫度為37±0.1℃，通入95%O2+5%CO2，通過(guò)調(diào)節(jié)螺母加1 g的負(fù)荷（10 mN），平衡40 min，待子宮收縮穩(wěn)定，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。預(yù)先記錄10 min正常收縮曲線，隨后加入PGF2α（終濃度1 μg·L-1），作用15 min后分別加入桂枝茯苓膠囊（終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg·mL-1）或成分組合物（終濃度為0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）（溶于含1%DMSO去離子水），以含1%DMSO去離子水為對(duì)照組。記錄給藥后子宮收縮幅度，觀察藥物對(duì)PGF2α致子宮節(jié)律收縮的對(duì)抗作用，統(tǒng)計(jì)給藥前10 min及給藥后10 min內(nèi)子宮的收縮幅度，計(jì)算抑制率%（IR），IR=（給藥前幅值-給藥后幅值）/給藥前幅值×100%。

2.2 桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制子宮平滑肌收縮的離體研究

向浸泡小鼠子宮平滑肌的浴槽中分別加入以下樣品：除正常對(duì)照組外各組均加入PGF2α（終濃度1 μg·L-1），15 min后桂枝茯苓膠囊組再加入終濃度為130.4 μg·mL-1的藥物，成分組合物組再加入終濃度為46.67 μg·mL-1的藥物，正常組及PGF2α加入含1%DMSO去離子水。15 min后各組取小鼠子宮平滑肌組織采用Western blot方法檢測(cè)p42/44 MAPK、Cx43蛋白表達(dá)情況。主要步驟如下：稱取小鼠平滑肌組織，液氮速凍、研磨粉碎后，加入含有蛋白酶抑制劑的全細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA法蛋白定量。12%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次后，分別加入兔抗鼠p42/44 MAPK（以1∶500稀釋?zhuān)x43（以1∶800稀釋?zhuān)┖挺?actin（以1∶1 000稀釋?zhuān)┮豢埂?℃孵育過(guò)夜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（以1∶2 000稀釋?zhuān)┓跤? h。用化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

2.3 結(jié)果處理和分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)作圖軟件分析，結(jié)果采用均數(shù)±方差（）表示。組間比較采用two-way ANOVA分析，P=0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桂枝茯苓膠囊成分組合物抑制小鼠離體子宮收縮量效關(guān)系考察

結(jié)果顯示，桂枝茯苓膠囊3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg·mL-1及組合物0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1劑量下對(duì)子宮平滑肌收縮的抑制作用逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。桂枝茯苓膠囊的IC50為130.40 μg·mL-1，組合物的IC50為46.67 μg·mL-1。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

3.2 桂枝茯苓膠囊成分組合物抑制子宮平滑肌收縮的離體研究

桂枝茯苓膠囊及組合物p42/44MAPK磷酸化和Cx43的蛋白表達(dá)水平相比較PGF2α誘導(dǎo)組灰度值均下降，即 桂枝茯苓膠囊及其組合物能抑制PGF2α誘導(dǎo)的p42/44MAPK磷酸化和 Cx43水平升高。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

表1 桂枝茯苓膠囊對(duì)PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

表1 桂枝茯苓膠囊對(duì)PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

注：與溶媒組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表2 成分組合物PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

表2 成分組合物PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

注：與溶媒組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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圖1 桂枝茯苓膠囊及其組合物對(duì)p42/44 MAPK磷酸化、Cx43蛋白表達(dá)水平影響

4 討論

原發(fā)性痛經(jīng)是指月經(jīng)前及行經(jīng)期間，下腹及腰部痙攣性疼痛。病理改變主要包括子宮平滑肌和子宮壁螺旋動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮、缺血以及缺氧等。流行病學(xué)研究表明原發(fā)性痛經(jīng)是目前婦科最常見(jiàn)疾病[8]。原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制，主要與月經(jīng)期子宮內(nèi)膜合成和釋放前列腺素增加有關(guān)[9，10]，也與精神、及某些生化代謝物質(zhì)有關(guān)[11，12]，臨床上常用非甾體抗炎藥和口服避孕藥治療痛經(jīng)[13]。

圖2 桂枝茯苓膠囊及其組合物對(duì)p42/44 MAPK磷酸化、Cx43蛋白表達(dá)

MAPK是一組在真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞者，參與多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)[14]。研究認(rèn)為子宮平滑肌組織中表達(dá)Cx43[15，16]。Cx43在 細(xì)胞膜上形成細(xì)胞間隙連接通道分子，使功能相同的細(xì)胞產(chǎn)生同步效應(yīng)，對(duì)子宮平滑肌收縮的協(xié)調(diào)性發(fā)揮重要的調(diào)控功能[17]。PGF2α致子宮平滑肌收縮與p42/44MAPKCx43信號(hào)途徑有關(guān)[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂枝茯苓膠囊及成分組合物系列濃度對(duì)子宮收縮具有抑制作用，且具有量效關(guān)系，桂枝茯苓膠囊及組合物p42/44MAPK磷酸化和Cx43的蛋白表達(dá)水平相比較PGF2α誘導(dǎo)組灰度值均下降，結(jié)果提示桂枝茯苓膠囊對(duì)離子子宮具有顯著抑制作用，其機(jī)制與抑制PGF2α誘導(dǎo)的p42/44MAPK磷酸化和Cx43水平升高有關(guān)，桂枝茯苓膠囊對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)具有治療作用，其中14個(gè)化合物可能起主要作用。

1 李萍,曹保利.桂枝茯苓膠 囊治療原發(fā)性痛經(jīng)90例臨床觀察.天津藥學(xué), 2009, 21(1)∶ 34.

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3 馬玉俠,衣華強(qiáng),孫玉國(guó),等.痛經(jīng) 相關(guān)測(cè)評(píng)量表與評(píng)估方法研究進(jìn)展.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 339(4)∶ 347-348.

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Inhibition Effects and Mechanism of Guizhi Fuling Capsule and Its Containing Active Ingredients on Uterine Contraction

Sun Lan1,2,3, Zhou Jun2,3, Zong Shaobo2,3, Ding Gang2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei2,3, Kou Junping1
(1. Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and Translational Research, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China; 3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China)

The goal of the investigation was to uncover the inhibition effects of Guizhi Fuling Capsule (GZFLC) and its fourteen active ingredients against uterine contraction and the mechanism. PGF2αinduced uterine smooth muscle contraction model was established to observe the inhibition effects of GZFLC and its active ingredients. Expressions of p42/44 mitogen-activated protein kinase (p42/44 MAPK) phosphorylation and gap junction protein connexin 43 (Cx43) were quantified in order to test the inhibition effects against uterine smooth muscle contraction in vitro and elucidate possible mechanisms. The results showed that the concentrations of GZFLC and the containing active ingredients, which induced 50% inhibition (IC50) of uterine contraction amplitude, were 130.40 and 46.67 μg·mL-1, respectively. GZFLC and its active ingredients also suppressed p42/44 MAPK phosphorylation level and Cx43 expression in the uterus tissue in PGF2α-induced model animals. It was concluded that GZFLC and the containing active ingredients inhibited the uterine smooth muscle contraction which induced by PGF2α. And the mechanism may be related to lower p42/44 MAPK phosphorylation and Cx43 protein levels in uterine.

Guizhi Fuling capsule, active ingredients, PGF2α, uterine contraction

10.11842/wst.2016.02.021

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-02-04

修回日期：2015-11-02

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)“十二五”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開(kāi)發(fā)；寇俊萍，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥及中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。