劉金欣，潘 敏，張改霞，趙春穎，石林春，＊＊

（1. 承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德 067000；2. 濟(jì)南市婦幼保健院 濟(jì)南 250001；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

基于ITS2序列的中藥材桔梗種子DNA條形碼鑒定＊

劉金欣1，潘 敏2，張改霞3，趙春穎1，石林春1，3＊＊

（1. 承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德 067000；2. 濟(jì)南市婦幼保健院 濟(jì)南 250001；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：桔梗為中國(guó)常用大宗藥食兼用中藥材，種植面積廣，建立基于DNA條形碼技術(shù)的桔梗種子鑒定方法具有重要意義。方法：本研究共收集29份中藥材桔?；参锖头N子樣品；利用體式顯微鏡、X射線影像工作站觀察種子的形態(tài)特征及種子成熟度；優(yōu)化DNA提取方法；基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn）和《中國(guó)藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》對(duì)種子物種進(jìn)行鑒定。結(jié)果：不同群體來(lái)源或同一群體來(lái)源桔梗種子形態(tài)特征存在較大差異，識(shí)別困難；本實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)單粒桔梗種子（約1mg）的DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定；5份樣品同一群體內(nèi)種子ITS2序列存在差異；中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)和《中國(guó)藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》可以作為種子物種鑒定的依據(jù)。結(jié)論：DNA條形碼分子鑒定法可以對(duì)中藥材桔梗種子進(jìn)行鑒定，同時(shí)為中藥材種質(zhì)資源鑒定提供了新方法，對(duì)中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

桔梗 種子 形態(tài)特征 DNA條形碼 鑒定

據(jù)2015版中國(guó)藥典記載，中藥桔梗為桔?？贫嗄晟荼局参锝酃latycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.的干燥根[1]。桔梗為中國(guó)常用大宗藥材品種之一，性苦、辛，平，歸肺經(jīng)，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿等功效，主治咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿等癥[2]。近年來(lái)，桔梗市場(chǎng)需求量大，野生資源已不能滿足需求。中國(guó)自上世紀(jì)70年代起開始栽培桔梗，目前已形成山東淄博，安徽亳州、太和，內(nèi)蒙赤峰3大道地產(chǎn)區(qū)，山東省沂源縣三岔鄉(xiāng)GAP種植區(qū)生產(chǎn)的栽培桔梗已占據(jù)商品桔梗市場(chǎng)的主導(dǎo)地位[3]。桔梗是一種藥食兩用的中藥材，已列入衛(wèi)計(jì)委藥食同源食品目錄，為朝鮮族的傳統(tǒng)食物，在中國(guó)東北地區(qū)和韓國(guó)大量使用，其主要活性成分是皂苷，該類成分屬五環(huán)三萜衍生物，具有抗炎、祛痰、鎮(zhèn)咳、抗?jié)⒛c及抗腫瘤、降血壓、擴(kuò)張血管、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保肝、降血糖、抗膽堿、促進(jìn)膽酸分泌、抗氧化與美容、抗過(guò)敏及增強(qiáng)人體免疫力等多種藥理活性[4-7]。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA 序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充，已廣泛用于中藥材（包括藥材及部分藥材飲片）及基原物種的鑒定，特別是名貴珍稀瀕危中藥的鑒定，如冬蟲夏草、石斛等[8-11]。陳士林等建立的全球中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，已涵蓋中國(guó)、日本、韓國(guó)、印度、歐盟、美國(guó)等6國(guó)藥典的幾乎所有草藥品種，將中草藥鑒定從形態(tài)鑒定發(fā)展到DNA鑒定水平，被稱為中草藥鑒定的文藝復(fù)興[12]。辛天怡等將DNA 條形碼技術(shù)與二維碼（QR Code）技術(shù)相結(jié)合，建立中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管[13]。此外，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)“超級(jí)食品”枸杞子和紅景天飲片的鑒定，將DNA條形碼分子鑒定法擴(kuò)展到藥食同源中藥材和中藥材飲片的鑒定領(lǐng)域[14，15]。本研究嘗試將DNA條形碼分子鑒定法用于桔梗種子的真?zhèn)舞b定，以保障桔梗種植的種源可靠性，并進(jìn)一步嘗試擴(kuò)展DNA條形碼分子鑒定法的適用范圍。

1 材料方法

1.1 材料

本研究共收集29份樣品，包括中藥材桔梗基原植物樣品10份，中藥材桔梗種子樣品19份。桔?；参飿悠方?jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，存放在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。種子植物樣品采集于桔梗中藥材產(chǎn)地，樣品存放于國(guó)家藥用植物種質(zhì)資源庫(kù)，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息表

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)特征觀察

選擇飽滿成熟的桔梗種子，使用LY-WNHPCCD型動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)（成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司）觀察桔梗種子外部形態(tài)特征（如形狀、顏色、表面紋理等）。使用游標(biāo)卡尺（上海九量五金工具有限公司）測(cè)量桔梗種子長(zhǎng)、寬、厚。使用Carestream X射線影像工作站系統(tǒng)（加拿大Carestream Health公司）對(duì)桔梗種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。采用百粒法測(cè)定桔梗種子千粒重[16]。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

取1粒種子，使用75%乙醇擦拭表面，待乙醇揮干后置2.0 mL離心管中，用DNA提取研磨儀（RETSCH MM400，德國(guó)）研磨2 min（30次/s），使用天根植物DNA提取試劑盒提取總DNA，加入裂解液后，使用DNA提取研磨儀重復(fù)研磨1次，65℃水浴2 h，剩余步驟參照《中國(guó)藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[8]。用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國(guó)）檢測(cè)DNA質(zhì)量。PCR擴(kuò)增引物、體系及反應(yīng)條件參照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[9]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V5.1.5（Codon-Code Co.，美國(guó)）進(jìn)行拼接和校對(duì)。依照中藥材DNA條形碼指導(dǎo)原則進(jìn)行測(cè)序峰圖質(zhì)量評(píng)估?；陔[馬爾可夫模型（Hidden Markov model）注釋獲得ITS2序列[17]。使用MEGA 6.0進(jìn)行序列比對(duì)、變異分析和遺傳距離計(jì)算[18]。基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn）和《中國(guó)藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》進(jìn)行物種鑒定[8, 9]。

2 結(jié)果

2.1 桔梗種子形態(tài)特征

桔梗種子以倒卵狀橢圓形為主，成熟種子棕色或深褐色，成熟度較差的種子顏色稍淺，桔梗種子群體顏色不均勻。桔梗種子平均長(zhǎng)度2.21 cm，平均寬度1.34 cm，平均厚度0.67 cm，千粒平均質(zhì)量1.19 g，桔梗種子群體大小較不均勻。桔梗種子在自然光下有光澤，一側(cè)珠被表皮細(xì)胞外凸形成種翅，常較窄，顏色稍淺或呈淡棕黃色。桔梗種子在40倍體式顯微鏡下可觀察到較密的黑色細(xì)紋。X光透視觀察桔梗種子胚乳白色半透明，胚極小，呈一亮點(diǎn)，成熟度較差的種子顏色暗淡，胚乳不飽滿或觀察不到胚，桔梗種子群體成熟度差異較大。

2.2 桔梗種子DNA提取優(yōu)化、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

桔梗種子較小，單粒種子質(zhì)量?jī)H約1 mg，DNA提取需挑選成熟度較好的飽滿種子。桔梗種子胚乳具油性，含有較多的糖類、脂類和蛋白質(zhì)，消化后需加入與裂解液等體積的氯仿∶異戊醇混合液（體積比24∶1）進(jìn)行抽提，并加入等體積預(yù)冷異丙醇沉淀DNA，沉淀中常見(jiàn)部分白色膠狀物質(zhì)。由于桔梗種子較小，過(guò)柱純化后加入30-50 μL無(wú)菌水洗脫獲得DNA。NanoDrop 2000檢測(cè)DNA純度常較差，260/230常小于1，但不影響后續(xù)PCR擴(kuò)增和測(cè)序。所有樣品都可成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得高質(zhì)量雙向測(cè)序結(jié)果。

2.3 桔梗種子物種DNA鑒定和純度檢測(cè)

本研究共獲得67條序列，其中基原植物序列10條，種子序列57條，分為4個(gè)不同的單倍型，主導(dǎo)單倍型與《中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中桔梗主導(dǎo)單倍型序列特征相同。20位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)插入/缺失變異。59位點(diǎn)新發(fā)現(xiàn)T-C變異，為來(lái)自于河南和安徽的2份種子樣品。將所獲得的桔梗4個(gè)單倍型ITS2序列，依次輸入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn）的植物類藥材鑒定（ITS2）窗口，點(diǎn)擊提交進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示，所有4個(gè)單倍型均與桔梗科植物桔梗P. grandiflorum的序列最為接近。此外，14份樣品內(nèi)ITS2序列無(wú)差異，5份樣品內(nèi)ITS2序列存在差異。

圖1 種子群體圖、40倍顯微圖和X光透視圖

3 討論

3.1 市售桔梗種子形態(tài)特征差異較大，識(shí)別困難

桔梗為桔梗科多年生草本植物，據(jù)《中國(guó)植物志》英文修訂版記載，中國(guó)桔梗屬僅桔梗1個(gè)物種，花色藍(lán)色或紫色，少有粉色和白色。桔梗是一種藥、食、賞兼用植物，在中國(guó)、前蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮半島、日本列島均有分布，為廣布種，種質(zhì)資源豐富，不同種源甚至同一種源群體內(nèi)的種子形狀、顏色、種翅的寬窄、顏色等性狀存在明顯差異，單純依賴形態(tài)特征進(jìn)行鑒定較困難[19]。本研究結(jié)果表明，19份桔梗種子樣品中，5份樣品存在群體內(nèi)ITS2序列差異。自然條件下桔梗主要依靠異花授粉，自花授粉結(jié)實(shí)率低，不同種源雜交后收獲的F0種子中，存在不同于黑色或棕色的黃綠色、灰綠色桔梗種子或雜色種子及各種過(guò)渡類型的種皮顏色[20]。桔?；ㄆ谳^長(zhǎng)，市售桔梗種子的成熟度存在較大差異[21]。X光透視發(fā)現(xiàn)多數(shù)種子樣品存在不同比例種子的顏色暗淡，胚乳不飽滿或觀察不到胚。不同成熟度的桔梗種子不僅形態(tài)特征存在差異，而且影響種子的發(fā)芽率。

3.2 種子鑒定尚缺乏統(tǒng)一方法，DNA條形碼技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)

中藥材質(zhì)量控制需要中藥材生產(chǎn)的規(guī)范化，中藥材生產(chǎn)規(guī)范化需要中藥材種子生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化[22]。種子是中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)良品種及優(yōu)質(zhì)的種子是實(shí)現(xiàn)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。當(dāng)前中藥材種子處于管理真空，尚無(wú)專門針對(duì)中藥材種子質(zhì)量檢驗(yàn)、控制的機(jī)構(gòu)和執(zhí)法部門，在從法理職能上隸屬于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)，多數(shù)中藥材種子缺乏國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[23]。絕大部分種子主要來(lái)自藥材生產(chǎn)基地和農(nóng)戶留種，種子經(jīng)營(yíng)無(wú)專業(yè)市場(chǎng)與渠道，種子質(zhì)量參差不齊，種源混雜，存在摻偽現(xiàn)象[24]。中藥材種子以形態(tài)鑒定為主，如種子形狀、大小、顏色、光澤、表面紋理、表面附屬物、內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)（胚的性狀、大小、位置、胚乳）等[25]。某些特征常受種質(zhì)資源、群體差異、種子成熟度、自然天氣等影響，并不穩(wěn)定[19]。DNA條形碼技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)的障礙，鑒定客觀，其指導(dǎo)原則已經(jīng)納入中國(guó)藥典[26]。本研究?jī)?yōu)化種子DNA提取方法，可以獲得桔梗單粒種子的DNA條形碼序列，然后依照《中國(guó)藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對(duì)桔梗種子進(jìn)行鑒定，為其他中藥材種子鑒定提供參考。

表2 基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)的桔梗種子單倍型鑒定結(jié)果

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015∶ 277.

2 徐國(guó)鈞,徐珞珊.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究,南方協(xié)作組(第二冊(cè)).福建:福建科學(xué)技術(shù)出版社, 1997∶ 218-238.

3 胡世林.中國(guó)道地藥材. 哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社, 1989∶38.

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Identification of Platycodonis Radix Seeds by Using ITS2 DNA Barcode

Liu Jinxin1, Pan Min2, Zhang Gaixia3, Zhao Chunying1, Shi Linchun1, 3(1. Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Chinese Medicine, Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2. Jinan Maternity and Child Care Hospital, Jinan 250001, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, Peking Union Medical College, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100193, China )

Platycodonis radix is one of the common used herbs, and is widely applied for both medicines and food. To establish a method for identifying the Platycodonis radix by using DNA barcoding is a very important target. In this study, 29 specimens including leaves and seeds of Platycodonis radix had been collected from nine provinces. The morphological characters were surveyed with stereoscopic microscope and X-ray workstation. DNA was extracted from a single seed via optimizing the DNA extraction method. The species identification for each sample was carried out according to DNA barcode identification system (http://www.tcmabarcode.cn) and standard Platycodonis radix barcodes from the book, The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia. The results showed that the morphological characters and grades of maturity remain presented some differences among specimens from different sources. This experiment can realize the DNA extraction, PCR amplification and sequence determination of a single Platycodonis radix seed (about 1 mg). ITS2 sequences from five seed specimens lacked consistence. The Chinese material medica DNA barcode identification system and The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia can be used as references for the seed identification. It was concluded that the seed of traditional Chinese materials can be identified through DNA barcoding method, which will contribute to the seed and seedling standardization project of medicinal materials.

Platycodonis radix, seed, morphological character, DNA barcoding, identification

10.11842/wst.2016.02.005

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-01

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81303158）：全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定深層發(fā)酵靈芝菌株三萜高產(chǎn)關(guān)聯(lián)多態(tài)性位點(diǎn)，負(fù)責(zé)人：石林春；科學(xué)技術(shù)部國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI07B08）：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)示范研究子課題——中藥種子種苗 DNA條形碼鑒定及流通管理平臺(tái)的建立，負(fù)責(zé)人：陳士林。

＊＊ 通訊作者：石林春，副研究員，主要研究方向：中藥資源與鑒定研究。