賈 璇 任連海 席北斗 祝超偉 李鳴曉# 趙由才

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程系，北京 100048；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012；3.同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水生植物大量繁殖，蘆葦是我國(guó)濕地、草型湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在污水凈化和吸附重金屬方面尤為突出[1]。但蘆葦生長(zhǎng)末期除部分用作飼料、燃料外，大部分殘?bào)w在水中腐解，對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害[2]。蘆葦纖維素、半纖維素等有機(jī)質(zhì)含量高[3]，是生物質(zhì)能源化利用的理想原料，氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)工藝依據(jù)相分離原理，將厭氧發(fā)酵過(guò)程分為產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷階段，獲得氫氣和甲烷兩種能源，能源轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)89%，是實(shí)現(xiàn)蘆葦減排產(chǎn)能的重要途徑[4-6]。筆者長(zhǎng)期從事有機(jī)廢物厭氧聯(lián)產(chǎn)工藝研究[7-8]，由于厭氧聯(lián)產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，多種微生物相互作用機(jī)制不清，微環(huán)境難控，使工藝穩(wěn)定運(yùn)行困難。產(chǎn)甲烷菌是一類(lèi)極端厭氧古菌，位于厭氧消化食物鏈的最末端，是厭氧生物處理工藝中最重要的限速步驟，其群落的組成和數(shù)量的變化直接影響厭氧發(fā)酵速率和產(chǎn)氣量[9-10]。

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增為主的非培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展揭示了環(huán)境中龐大的微生物多樣性[11]。PCR—變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)不僅可以研究古菌群落在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)變化，還可以通過(guò)序列分析或探針雜交確定其中的種群組成[12-13]，對(duì)闡明厭氧聯(lián)產(chǎn)過(guò)程的微生物作用機(jī)制具有重要意義。KEYSER等[14]應(yīng)用DGGE技術(shù)測(cè)定了3種厭氧反應(yīng)器污泥顆粒中的產(chǎn)甲烷古菌的指紋圖譜，同時(shí)對(duì)產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)行了鑒定。王慶等[15]采用PCR—DGGE技術(shù)分析了農(nóng)村沼氣池產(chǎn)甲烷古菌的多樣性，其中以甲烷囊菌屬(Methanoculleus)和小甲烷粒菌屬(Methanocorpusculumparvum)為主。目前，已有的研究多集中在研究傳統(tǒng)單相厭氧發(fā)酵工藝中微生物群落變化[16-18]，但采用厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷工藝，針對(duì)水生植物秸稈開(kāi)展古菌群落特征及演替規(guī)律的研究還鮮有報(bào)道。

本研究以典型水生植物蘆葦為研究對(duì)象，采用PCR—DGGE技術(shù)分析氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段古菌群落的組成和結(jié)構(gòu)，探討聯(lián)產(chǎn)過(guò)程中古菌群落的演替規(guī)律，以期為厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)的微生物作用機(jī)制和生物強(qiáng)化研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

蘆葦采集自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)烏梁素海，蘆葦干樣含碳量33.77%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，含氮量0.57%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，總固體(TS)98.68%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，揮發(fā)性固體(VS)91.39%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，灰分7.28%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。接種的厭氧消化污泥含碳量35.20%，含氮量3.06%，TS 16.69%，VS 11.97%，灰分4.72%。取32 g蘆葦干樣，加入10 mg/g纖維素酶R-10浸泡，固液比為1∶12(質(zhì)量比)，48 ℃進(jìn)行酶解預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)間48 h。預(yù)處理后的蘆葦樣品接種200 mL厭氧消化污泥，污泥添加量為發(fā)酵總體積的12.5% (體積分?jǐn)?shù))，培養(yǎng)體積1.6 L，通入高純氮?dú)? min以排除反應(yīng)瓶中的空氣，37 ℃中溫發(fā)酵，攪拌速度150 r/min。采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)初始pH為5，產(chǎn)氫階段發(fā)酵周期為4 d，分別于0、6、12、24、36、60、96 h采集樣品，編號(hào)為H1～H7；待產(chǎn)氫過(guò)程結(jié)束，調(diào)節(jié)pH至7，產(chǎn)甲烷階段發(fā)酵周期為18 d，分別于42、66、90、114、162、210、258、306、432 h采集樣品，編號(hào)為M1～M9。

1.2 總DNA提取

采用BIOTEKE淤泥基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 古菌目的片段擴(kuò)增

PCR體系：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 20～50 ng、Tag聚合酶(Takara，大連)1.5 U、滅菌高純水補(bǔ)齊至50 μL。

擴(kuò)增條件：采用Touch Down PCR，以增加產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，68～58 ℃退火30 s(退火溫度從68 ℃降到58 ℃，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，經(jīng)10個(gè)循環(huán)后，退火溫度降至58 ℃)，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用于PCR擴(kuò)增的引物如表1所示。

1.4 PCR—DGGE分析

1.4.1 PCR產(chǎn)物DGGE

PCR產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小和濃度。取20 μL PCR產(chǎn)物(約200 ng)與10 μL 5×Loading buffer混勻后進(jìn)行電泳，以去離子甲酰胺和尿素為變性劑，其中古菌變性梯度為40%～70%，聚丙烯酰胺膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，電壓20 V預(yù)電泳10 min，電壓130 V電泳6 h，溫度恒定為60 ℃。電泳結(jié)束后，凝膠以Gel-Red染色劑染色30 min，洗滌后于Bio-Rad USA上掃描成像分析。

1.4.2 條帶回收及純化

在345 nm波長(zhǎng)下將優(yōu)勢(shì)差異條帶和共性條帶切下，洗凈后浸泡于裝有高純水的2 mL無(wú)菌離心管中，搗碎后加入60 μL TE緩沖溶液，4 ℃放置24 h。取5 μL回收產(chǎn)物作為模板，選用無(wú)GC夾的上述PCR擴(kuò)增的引物，按1.3節(jié)再次擴(kuò)增。選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。

表1 用于古菌PCR擴(kuò)增的引物

圖1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段累積產(chǎn)氣量和生物氣產(chǎn)量變化情況Fig.1 The maximum cumulative biogas production and proportion from reed under different stages

1.4.3 克隆測(cè)序

DNA溶液全量10 μL，加入100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，再加入890 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用3730xl測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank并獲得接受號(hào)。利用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，獲得相關(guān)種屬的序列信息。

1.5 DGGE圖譜相似性分析

結(jié)合ImageJ、Mathworks Matlab v7.1以及PAST軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析。首先用ImageJ軟件對(duì)DGGE圖譜數(shù)字化，再以Mathworks Matlab v7.1軟件對(duì)數(shù)字化DGGE圖譜進(jìn)行補(bǔ)點(diǎn)處理，最后用PAST軟件選取歐幾里德距離作為參數(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.6 分析方法

累積產(chǎn)氣量采用排水法測(cè)定。氫氣和甲烷產(chǎn)量采用SP-6890型氣相色譜儀測(cè)定。色譜條件：氫火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱為3 mm內(nèi)徑不銹鋼填充柱(TDx-01高分子小球)，柱室、汽化室和檢測(cè)室的溫度分別為120、150、150 ℃，氬氣為載氣，純度≥99.999%，流速為40 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷情況

蘆葦秸稈經(jīng)纖維素酶R-10處理后進(jìn)行厭氧聯(lián)產(chǎn)，結(jié)果如圖1所示。產(chǎn)氫階段初期酶處理組產(chǎn)氣量迅速上升，12 h后產(chǎn)氣量緩慢上升，產(chǎn)氫階段最大累積產(chǎn)氣量為1 360 mL，是未經(jīng)預(yù)處理對(duì)照組的3倍。酶處理組氫氣體積分?jǐn)?shù)12 h達(dá)到最高，為52.1%，隨著反應(yīng)進(jìn)行氫氣體積分?jǐn)?shù)逐漸降低。產(chǎn)甲烷階段，酶處理組累積產(chǎn)氣量隨時(shí)間穩(wěn)定上升，353 h累積產(chǎn)氣量最高達(dá)4 400 mL，是對(duì)照組的5倍，甲烷體積分?jǐn)?shù)隨時(shí)間顯著上升。對(duì)照組最大甲烷體積分?jǐn)?shù)為68.4%。可見(jiàn)，蘆葦經(jīng)纖維素酶R-10預(yù)處理后氫氣和甲烷產(chǎn)量顯著提高。KAPOOR等[19]指出，纖維素酶可特異性地吸附在秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)上，促進(jìn)植物細(xì)胞壁溶解，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶解出來(lái)，并將大分子多糖、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)降解成小分子物質(zhì)，提高了底物利用效率和產(chǎn)氣潛力。

2.2 古菌DGGE圖譜分析

從圖2可以看出，厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌DGGE條帶種類(lèi)和分布表現(xiàn)出了明顯的差異，產(chǎn)甲烷階段的古菌種類(lèi)和數(shù)目明顯高于產(chǎn)氫階段，尤其是產(chǎn)甲烷階段初期表現(xiàn)出了較高的微生物多樣性。條帶7、10、13為兩個(gè)階段的共有條帶，貫穿整個(gè)厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)過(guò)程，但在兩個(gè)階段發(fā)酵過(guò)程中各條帶亮度和持續(xù)時(shí)間不同。條帶7在產(chǎn)甲烷階段的中后期尤其是泳道M6、M7、M8中亮度高、寬度大和持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，但在產(chǎn)氫階段亮度低、寬度窄、持續(xù)時(shí)間很短。條帶10則在產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷初期較為明顯，到產(chǎn)甲烷高峰期逐漸減弱，兩個(gè)階段特有的生態(tài)條件為不同微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造了適宜的條件，造成了兩個(gè)階段優(yōu)勢(shì)古菌的差異性。

圖2 古菌DGGE圖譜Fig.2 Archaea DGGE band patterns

條帶2、5分別在產(chǎn)氫階段后期和產(chǎn)氫階段初期出現(xiàn)，為產(chǎn)氫階段的特有條帶，產(chǎn)氫階段末期泳道H7至產(chǎn)甲烷階段，該條帶消失。條帶3、8、12、14、15是產(chǎn)甲烷階段的特有條帶，出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段，為產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢(shì)菌群。產(chǎn)甲烷階段，發(fā)酵環(huán)境pH為中性，適宜產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)，使底物中的古菌數(shù)量顯著提高。而條帶4僅出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段初期，即泳道H7和M1～M3?？梢?jiàn)，隨著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進(jìn)行，古菌群落組成發(fā)生了顯著的演替變化，表現(xiàn)在DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化。

2.3 古菌群落相似性分析

利用 BIO-RAD QUANTITY ONE 4.6.2軟件處理所得到圖譜，用戴斯系數(shù)(Cs)計(jì)算微生物群落的相似性：

Cs = 2j/(a+b)

(1)

式中：j為樣品 A 和 B 共有的條帶數(shù)；a和b分別為樣品 A 和 B 中各自的條帶數(shù)。

Cs取值范圍為0(沒(méi)有相同條帶)～1(所有的條帶相同)。依據(jù) Complete Linkage算法對(duì)DGGE條帶進(jìn)行聚類(lèi)分析。

氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段代謝產(chǎn)物的相似性(見(jiàn)表2)和聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖3)表明，相鄰時(shí)間的圖譜相似性較高，聚為一類(lèi)，不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低。在產(chǎn)氫階段初期，種群結(jié)構(gòu)的Cs最高達(dá)94.2(泳道H1、H4)。隨后產(chǎn)氫階段的種群結(jié)構(gòu)Cs均較高，分別為86.8(泳道H1、H2)、79.0(泳道H1、H3)、71.0(泳道H1、H7)?？梢?jiàn)，產(chǎn)氫階段古菌的微生物群落結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，古菌種類(lèi)基本保持不變。

表2 基于Cs的相似性矩陣

表3 古菌條帶序列的比對(duì)結(jié)果

圖3 古菌DGGE圖譜的聚類(lèi)分析圖Fig.3 Clustering analysis for DGGE profile of archaea

產(chǎn)甲烷階段中期，也是產(chǎn)甲烷高峰期，種群結(jié)構(gòu)相似性的Cs分別為77.9(泳道M6、M7)、90.9(泳道M6、M8)，產(chǎn)甲烷末期，Cs顯著下降為58.0(泳道M6、M9)，隨著產(chǎn)甲烷的進(jìn)行，古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著更替，產(chǎn)氫階段初期和產(chǎn)甲烷階段末期的Cs僅為43.4(H1、M9)?？梢?jiàn)，厭氧聯(lián)產(chǎn)過(guò)程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替，其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

2.4 古菌群落序列分析

將厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌條帶進(jìn)行切膠測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表3所示。測(cè)得的序列條帶與基因庫(kù)中已知微生物的同源性比例均在99%以上，經(jīng)BLAST后的古菌序列主要為Methanoculleus、產(chǎn)甲烷古菌(Methanogenicarchaeon)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和傳統(tǒng)方法不可培養(yǎng)的unculturedMethanosarcinalesarchaeon。其中，Methanogenicarchaeon、Methanoculleushoronobensis等產(chǎn)甲烷菌在厭氧發(fā)酵過(guò)程中始終存在，主要通過(guò)氫營(yíng)養(yǎng)途徑合成甲烷。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢(shì)古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon(條帶10)，屬于不可培養(yǎng)微生物，能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷，它們通過(guò)裂解乙酸，還原甲基碳產(chǎn)生甲烷，同時(shí)氧化其羧基碳產(chǎn)生二氧化碳[20]。產(chǎn)氫高峰期，Methanoculleusmarisnigri(條帶2)出現(xiàn)。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷階段的過(guò)渡期，出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon(條帶9)，在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期，古菌群落豐富，其中Methanoculleusbourgensis(條帶3)是產(chǎn)甲烷階段的優(yōu)勢(shì)微生物[21]。 SONG等[22]也從秸稈和畜禽糞便混合厭氧消化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了Methanosarcina、Methanosaeta、Methanoculleus等6類(lèi)產(chǎn)甲烷菌。

3 結(jié) 論

采用PCR—DGGE技術(shù)，研究了蘆葦厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過(guò)程中古菌群落組成和演替規(guī)律。隨著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進(jìn)行， DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化，群落相似性和聚類(lèi)分析表明，相鄰時(shí)間的圖譜相似性較高，聚為一類(lèi)，不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低，厭氧聯(lián)產(chǎn)過(guò)程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替，其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

序列分析表明，厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過(guò)程中存在古菌主要有Methanoculleus、Methanogenicarchaeon、Methanobacterium和unculturedMethanosarcinalesarchaeon等。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢(shì)古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon，能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷。產(chǎn)氫高峰期，出現(xiàn)Methanoculleusmarisnigri。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷的過(guò)渡期，出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon，在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期，古菌群落豐富，Methanoculleusbourgensis是產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢(shì)菌。

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