孫偉（吉林省五星動(dòng)物保健藥廠，吉林　長春　130062）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法及避免污染的措施

孫偉（吉林省五星動(dòng)物保健藥廠，吉林長春130062）

醫(yī)學(xué)研究中最具技術(shù)含量的研究手段就是細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)它還是生物學(xué)研究中應(yīng)用比較廣泛的一種方法。下面本文就細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法進(jìn)行分析，觀察其操作中引發(fā)污染的情況，同時(shí)提出幾點(diǎn)避免污染的措施，內(nèi)容如下。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；污染；措施

1　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法分析

1.1細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞的原代培養(yǎng)是指取樣完成后的第一次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，它能夠在細(xì)胞分化、藥物測(cè)試或病毒試驗(yàn)等方面取得顯著培養(yǎng)效果。其技術(shù)的應(yīng)用首先先對(duì)提取的樣品組織進(jìn)行清洗，然后將其切成較小組織塊，可在1或2mm，再給予分散劑擴(kuò)大組織塊，時(shí)間1小時(shí)或半小時(shí)，之后進(jìn)行吹打，并在混勻后利用過濾網(wǎng)濾過，將細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)離心出來，放在對(duì)應(yīng)濃度的培養(yǎng)基上，調(diào)整好培養(yǎng)箱，溫度在37攝氏度，二氧化碳在5%，將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，此技術(shù)的試驗(yàn)成功率很高。

1.2細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)

傳代培養(yǎng)的應(yīng)用是在離體細(xì)胞生長一定時(shí)間后，當(dāng)其發(fā)生分裂且增殖逐漸緩慢或要終止生長死亡前，從一個(gè)培養(yǎng)瓶按一定比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)和生殖的方法，這種方法被稱作傳代培養(yǎng)技術(shù)。此技術(shù)的應(yīng)用首先將原舊培養(yǎng)液吸出，取PBS緩沖液對(duì)其進(jìn)行兩次沖洗，然后取胰蛋白酶液滴入其中給予消化處理，之后利用顯微鏡進(jìn)行查看，待細(xì)胞恢復(fù)飽滿樣時(shí)，將胰酶液吸出后再將新鮮血清培養(yǎng)基加入到瓶中，避免細(xì)胞粘壁進(jìn)行吹打，并將其分裝于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，保證培養(yǎng)液充分并使細(xì)胞均勻浮于上面，之后加強(qiáng)觀察，一旦又出現(xiàn)細(xì)胞分裂到一定程度時(shí)再給予傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞凍存技術(shù)

細(xì)胞的凍存可以有效保證細(xì)胞活性和長期保存，一般在～80攝氏度的冷存環(huán)境下細(xì)胞可儲(chǔ)存一年的時(shí)間，若在液氮環(huán)境下，～196攝氏度中能夠長期保存，直至使用，也有相關(guān)學(xué)者表明，長期保存的牙髓成纖維細(xì)胞，其使用率及成活率在80%以上。這種凍存技術(shù)的操作中，在細(xì)胞凍存前應(yīng)該先對(duì)對(duì)數(shù)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后將其去除，再投入消化液、離心，離心后將上清液去除，加入凍存液，待細(xì)胞密度適度調(diào)整以后，取懸液細(xì)胞并分別裝在凍存管中，封閉，明確寫明細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存時(shí)間等，先于4攝氏度存放半小時(shí)，再移入～20攝氏度冷箱內(nèi)凍一小時(shí)，之后放在～80攝氏度凍箱內(nèi)凍存24小時(shí)，最后可置于電子技術(shù)控制的冰凍箱中長久存儲(chǔ)。

1.4細(xì)胞的復(fù)蘇技術(shù)

細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)的應(yīng)用主要是對(duì)凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，促使其恢復(fù)活性，當(dāng)凍存管從液氮環(huán)境中取出后，馬上放入準(zhǔn)備好的37攝氏度水環(huán)境中進(jìn)行快速、反復(fù)晃動(dòng)，晃致凍存液徹底融化為止，然后將融化后的細(xì)胞置入離心管內(nèi)，取4ml培養(yǎng)液漸漸滴入其中，用每分鐘1000轉(zhuǎn)速度離心，然后在細(xì)胞沉淀以后進(jìn)行密度調(diào)整，再行細(xì)胞培養(yǎng)。

2　細(xì)胞培養(yǎng)中引起污染產(chǎn)生的原因

2.1微生物

微生物在生活環(huán)境中是無處不在的，無論是靜止物體，還是人們皮膚表層、動(dòng)物皮毛等，其表面均存在細(xì)菌。而在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，如果工作人員對(duì)微生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)不了解或沒有經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)，其操作中會(huì)忽視很多細(xì)節(jié)，造成微生物污染，如細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基、器皿、使用設(shè)施、從一處轉(zhuǎn)移另一處時(shí)等，這些操作若不能有效避免，嚴(yán)格無菌操作，或在切割時(shí)不遵從無菌切開等，均可產(chǎn)生微生物污染。

2.2工作人員

人體是在不斷活動(dòng)的，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員是產(chǎn)生污染的最大來源，細(xì)胞培養(yǎng)各種操作都需要工作人員進(jìn)行，其皮膚鱗屑、活動(dòng)中帶動(dòng)空氣或說話時(shí)飛沫與口腔內(nèi)存在的多種微生物等，均可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成污染威脅，而且一旦工作人員攜帶病菌或感染病毒，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室就是一個(gè)高危污染源。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)口、棚板口、排水口等各種通道也存在不斷產(chǎn)生新污染的危害，像一些水槽、潮濕培養(yǎng)箱等潮濕地方也存在滋生細(xì)菌并提供污染的危險(xiǎn)。

2.3試劑

細(xì)胞培養(yǎng)中試劑的使用同樣存在一定潛在污染概率，購進(jìn)的試劑及培養(yǎng)基具體的應(yīng)用要明確，它們有無細(xì)菌，具體作用及有無必要進(jìn)行滅菌等。就如生長因子或血清在培養(yǎng)試驗(yàn)中，易發(fā)生病毒污染，所以說有的試劑原材料購進(jìn)時(shí)未滅菌，而有的培養(yǎng)基，如豬胰蛋白酶，它含有動(dòng)物病毒，試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此需要對(duì)試劑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定其使用的可靠，減低試劑使用不當(dāng)引起的污染。

3　避免污染的措施

3.1工作人員和環(huán)境

工作人員進(jìn)實(shí)驗(yàn)室行細(xì)胞培養(yǎng)前必須徹底對(duì)手、手臂清潔和消毒，穿戴一次性膠手套、無菌外衣、鞋，扎好袖口；細(xì)胞培養(yǎng)前將各種用具放于無菌照射下滅菌30min；各操作必須按照無菌操作流程進(jìn)行；同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)臺(tái)與培養(yǎng)儲(chǔ)存柜、清潔區(qū)等要保持較遠(yuǎn)距離；定期對(duì)潮濕區(qū)域檢測(cè)，及時(shí)給予處理，防止產(chǎn)生污染。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)的用品和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)中涉及的各種如試管、過濾器等用品，使用前均進(jìn)行酒精噴擦，酒精度80%；使用的一次性無菌塑料用品開封后必須單獨(dú)存放；試驗(yàn)中試劑瓶打開后，將蓋口向下置于無菌臺(tái)上，關(guān)蓋前必須用酒精燈烤后在蓋嚴(yán)；試劑的選購嚴(yán)格檢驗(yàn)生產(chǎn)日期、批次等，對(duì)一些沒有滅菌的試劑進(jìn)行評(píng)估確定后再使用等。

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