廖 嫻，黃月純

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

中藥顯微鑒別的實(shí)習(xí)帶教探討

廖 嫻，黃月純

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

中藥；顯微鑒別；實(shí)習(xí)帶教

中藥學(xué)或藥學(xué)專業(yè)學(xué)生在實(shí)習(xí)之前，經(jīng)過幾年緊張的基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)教學(xué)的學(xué)習(xí)后進(jìn)入醫(yī)院、藥廠等單位實(shí)習(xí)，通過實(shí)習(xí)既可將課堂上所學(xué)的理論、技能應(yīng)用于實(shí)踐，又可鞏固所學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的操作技能，為畢業(yè)后獨(dú)立工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。我院是一所綜合性的教學(xué)醫(yī)院，藥劑科在每年的實(shí)習(xí)生帶教工作中都肩負(fù)著重要任務(wù)，藥檢室是藥劑科的實(shí)習(xí)班組之一，對(duì)于畢業(yè)實(shí)習(xí)生，在藥檢室安排的實(shí)習(xí)時(shí)間大多為1～2周，時(shí)間較短，但涉及的專業(yè)知識(shí)面較廣[1]。近年來國家有關(guān)部門對(duì)醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制要求不斷提高，要求制劑用的中藥飲片必須檢驗(yàn)合格，《中國藥典》收載的中藥飲片大多有顯微鑒別項(xiàng)目，藥監(jiān)部門對(duì)醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有了更明確的要求，制劑成品中有關(guān)顯微鑒別的項(xiàng)目也越來越多。因此，操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的中藥顯微鑒定項(xiàng)目亦成了醫(yī)院制劑藥檢室的重要工作之一。本文根據(jù)學(xué)生的實(shí)習(xí)時(shí)間及以往帶教中遇到的問題，對(duì)顯微鑒別實(shí)習(xí)帶教模式進(jìn)行探討。

1 崗前加強(qiáng)制度和安全教育

組織學(xué)生學(xué)習(xí)醫(yī)院和藥檢室相關(guān)的規(guī)章制度及實(shí)習(xí)期間的紀(jì)律要求。由于藥檢工作每天都涉及多種試劑、儀器的使用，顯微鑒別涉及一些易燃易爆的溶劑，如酒精燈的使用。因此要求實(shí)習(xí)學(xué)生必須有很好的安全意識(shí)，帶教教師必須給學(xué)生講解實(shí)驗(yàn)室的一般安全知識(shí)及一般事故的處理方法，確保自身安全和實(shí)驗(yàn)室的安全[2]。

2 顯微鑒別技術(shù)的介紹

顯微鑒別是利用顯微鏡對(duì)藥材或飲片的切片、粉末、解離組織或表面制片及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等進(jìn)行鑒別的一種方法。該方法使用的儀器、試劑較少，操作簡便、易行，判斷準(zhǔn)確，在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較為廣泛。另外，在新版《中國藥典》中應(yīng)用顯微鑒別方法的中藥材和中成藥也特別多。

根據(jù)對(duì)近年來中藥或藥學(xué)專業(yè)實(shí)習(xí)生的了解，他們大多數(shù)只是曾經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行中藥材的顯微簡單操作，手工描繪顯微圖譜，較少涉及中藥復(fù)方制劑的顯微鑒別項(xiàng)目，亦缺乏采用專用攝像系統(tǒng)的顯微鑒別規(guī)范化操作。因此，在實(shí)驗(yàn)前就顯微鑒別操作技術(shù)方面的一些共性問題對(duì)學(xué)生進(jìn)行介紹非常有必要。

3 顯微鑒別實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的掌握

3.1 試液的合理使用

要做好顯微檢定，制作良好的切片是關(guān)鍵，而各種試液的合理使用顯得尤為重要。為了能夠清楚地觀察藥材組織構(gòu)造的細(xì)胞及其內(nèi)含物的形狀，必須把切片或粉末標(biāo)準(zhǔn)片用適當(dāng)?shù)脑囈哼M(jìn)行處理和封藏，試液的選擇必須具有合理性[3]。學(xué)生開始操作時(shí)，對(duì)觀察不同組織、細(xì)胞等所使用的試液比較模糊，所選擇的試液有時(shí)也不合適，在一定程度上影響了制片的效果。

制片常用的試液主要有：（1）水合氯醛，此液為常用封藏液，也是透化劑，可使干縮的細(xì)胞膨脹而透明，并能溶解淀粉粒、樹脂、蛋白質(zhì)、葉綠素及揮發(fā)油等。此法加入試液后需適當(dāng)加熱，使切片清凈、透明，適用于觀察組織構(gòu)造和細(xì)胞形狀及葉片、花和花粉粒，尤其適于觀察草酸鈣結(jié)晶。（2）水或稀甘油，切片直接加水或稀甘油封藏，適用于觀察細(xì)胞壁顏色及淀粉粒、油滴、樹脂等。（3）甘油醋酸試液（斯氏液），此液為常用封藏液，專用于觀察淀粉粒形態(tài)，可使淀粉粒保持原形，便于測(cè)量其大小。（4）甘油乙醇試液，此液為封藏液，也是軟化劑，常用于保存植物性材料及臨時(shí)切片，有軟化組織的作用。中藥的顯微鑒定中除應(yīng)用以上幾種透化試劑外，還有以下幾種常用的顯色試劑：間苯三酚試液與鹽酸合用可使木化細(xì)胞壁染成紅色或紫紅色；蘇丹Ⅲ試液可使木栓化、角質(zhì)化細(xì)胞壁及脂肪油、揮發(fā)油、樹脂等染成棕色或黃棕色；碘試液使淀粉粒染成藍(lán)色或紫色。

3.2 藥材和飲片顯微制片

選好了所需要的試液后，就要將樣品制成適于鏡檢的標(biāo)本，這個(gè)步驟是顯微鑒別的關(guān)鍵，學(xué)生只有掌握好制片的方法，才能更好地觀察到所需要的目標(biāo)物。對(duì)于完整的藥材或飲片可制成各種切面的切片；對(duì)于粉末藥材或飲片（包括丸、散等成方制劑）可直接裝片或適當(dāng)處理后制片。藥材或飲片切片標(biāo)本的制作方法較多，在日常的檢驗(yàn)中，經(jīng)常用到的就是徒手切片或滑走切片法、表面制片、花粉粒與孢子制片、磨片法制片、粉末制片等，其中最常用到且制片較簡單的就是粉末制片。粉末制片主要用于粉末狀的藥材和飲片的觀察。學(xué)生在實(shí)習(xí)期間顯微鑒別主要用到的也是粉末制片。

在藥材或飲片粉末制備時(shí)，首先是取干燥藥材或飲片，用打粉機(jī)粉碎，粉末過四號(hào)或五號(hào)篩，裝瓶，貼上標(biāo)簽。學(xué)生在制備粉末時(shí)，要注意取樣的代表性，因?yàn)槿拥拇硇灾苯佑绊懙浇Y(jié)果的準(zhǔn)確性。例如根類藥材要切取根頭、根中段及根尾等部位，要全部磨粉，不得丟棄渣子，過篩，混合均勻。如果藥材要干燥，一般溫度不能超過60℃，以免淀粉粒糊化。

制片時(shí)，先用解剖針挑取樣品粉末少許，置載玻片的中央，加適宜的試液1～2滴，用針攪勻（如為酸或堿時(shí)應(yīng)用細(xì)玻棒代替針），待液體滲入粉末后，用左手食指與拇指夾持蓋玻片的邊緣，使其左側(cè)與藥液層左側(cè)接觸，再用右手持小鑷子或解剖針托住蓋玻片的右側(cè)，緩緩放下，使液體逐漸充滿蓋玻片下方。如果液體未充滿蓋玻片，應(yīng)該從邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過多，用濾紙片吸去溢出的液體。學(xué)生在開始制片時(shí)，往往加入的粉末太多，如取量多，顯微特征重疊輪廓不清，反而費(fèi)時(shí)，不易找到所需要的目標(biāo)物。

為了便于觀察某些組織等，經(jīng)常需要透化。如需透化，可在載玻片上放有粉末處滴加水合氯醛試液1～2滴，將載玻片于酒精燈火焰上方約1～2 cm處往返擺動(dòng)加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，補(bǔ)充試液后再加熱，直至切片透化完全為止。加熱溫度不宜過高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡。加熱時(shí)應(yīng)將載玻片不斷移動(dòng)，以免受熱不均而炸裂。透化后放冷，加甘油乙醇溶液1～2滴，蓋上蓋玻片。

3.3 顯微鏡的使用

學(xué)生在中學(xué)的時(shí)候就已經(jīng)開始接觸顯微鏡，對(duì)顯微鏡的操作比較熟悉，但是在操作過程中還是有幾點(diǎn)需要注意。（1）下降鏡筒時(shí)，一定要用雙眼從側(cè)邊注視目鏡，使之接近裝片，但又要防止鏡頭觸及裝片，否則會(huì)壓碎裝片和損壞物鏡。（2）有必要使用高倍物鏡時(shí)，必須先在低倍物鏡下將目標(biāo)移到視野的中心，然后換用高倍物鏡。因?yàn)樵诘捅段镧R下看到的物像放大倍數(shù)小，但看到的標(biāo)本實(shí)際面積大，容易找到目標(biāo)，而與低倍物鏡相比，高倍物鏡下看到的物像大，同樣的視野面積看到的標(biāo)本的實(shí)際面積小，在裝片不動(dòng)的情況下，高倍物鏡看到的只是低倍物鏡視野的中心部分。（3）換高倍物鏡時(shí)，千萬不可將鏡筒升高，正確的做法是直接轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換上高倍物鏡即可。（4）使用高倍物鏡之后，透鏡與裝片之間的距離很近，使用粗準(zhǔn)焦螺旋容易壓碎玻片和損壞透鏡，或者由于物像一閃而過，找不到要觀察的目標(biāo)，因此，必須用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦，細(xì)準(zhǔn)焦螺旋只在調(diào)節(jié)圖像清晰度時(shí)使用。

3.4 圖像處理

顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如物鏡為10×，目鏡為10×，其放大倍數(shù)就為10×10= 100。放大的是物體的直線長度和寬度而不是面積?，F(xiàn)在的顯微鏡大部分都安裝了拍照軟件，便于圖片的真實(shí)保存。本藥檢室所應(yīng)用的是明美圖像軟件，首先應(yīng)先把玻片移至空白處，做白平衡。采集圖像時(shí)，首先將圖像調(diào)節(jié)清晰，然后可以點(diǎn)擊更多參數(shù)進(jìn)一步調(diào)節(jié)圖像，如亮度、對(duì)比度、色調(diào)、飽和度、銳度和曝光度等。保存好的圖片可以通過靜態(tài)測(cè)量軟件標(biāo)記所需要的長度、面積等參數(shù)，但學(xué)生在使用靜態(tài)測(cè)量軟件的過程中，有時(shí)會(huì)忘記在對(duì)話框中選擇所拍攝圖像物鏡的倍數(shù)。

4 選擇有代表性的中藥讓學(xué)生參與檢驗(yàn)全過程

大黃是常用中藥，《中國藥典》大黃的顯微鑒別方法[4]涉及顯微鑒別的多個(gè)方面，可作為學(xué)生帶教的典型實(shí)例。大黃草酸鈣簇晶直徑大小范圍為20～160 μm，部分較大，直徑能達(dá)190 μm，是大黃的主要顯微特點(diǎn)。而中藥復(fù)方制劑特別是散劑、膏劑，由多味中藥組成，如本院制劑中的療筋膏含有大黃、赤芍等兩味中藥，且兩味中藥均具有草酸鈣簇晶，在擬訂標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，只有直徑能達(dá)50 μm，才是大黃的顯微特征。因此，在帶教過程中要讓學(xué)生了解制劑顯微標(biāo)準(zhǔn)制訂的依據(jù)以及與中藥（飲片）的區(qū)別。

在粉末制片中，取大黃粉末分別制透化片和水裝片。透化片的制作方法：取大黃粉末少許放于載玻片上，滴加1～2滴水合氯醛，攪勻，在酒精燈上加熱透化，避免蒸干，反復(fù)透化2～3次，稍冷卻后滴加1滴稀甘油，蓋上蓋玻片，鏡檢，觀察草酸鈣簇晶。水裝片的制作方法：取大黃粉末滴加純化水1～2滴攪拌均勻，蓋上蓋玻片，鏡檢淀粉粒。另取療筋膏透化片，觀察草酸鈣簇晶。按照顯微鏡的操作規(guī)程使用顯微鏡，雙擊打開明美圖像軟件采集圖像，保存好的圖片再利用靜態(tài)測(cè)量軟件標(biāo)記即完成。

[1]黃月純.中藥薄層色譜鑒別的實(shí)習(xí)帶教探討[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012，10（18）：65-66.

[2]許銳鑫.淺談化學(xué)實(shí)驗(yàn)的安全教學(xué)[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2003，21（9）：129.

[3]袁汀.在中藥檢驗(yàn)中應(yīng)用顯微鑒定的幾點(diǎn)體會(huì)[J].實(shí)用藥物與臨床，2002（S1）：87.

[4]國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015．

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1671-1246（2016）24-0069-02