王 怡 尹艷麗

（協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司 天津 300384）

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性

王 怡 尹艷麗

（協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司 天津 300384）

目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化方案和生物學(xué)特性檢驗(yàn)效果。方法：利用原代貼壁培養(yǎng)法和酶消化法對(duì)人臍帶內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用瑞氏染色法觀察培養(yǎng)后細(xì)胞的形態(tài)，并利用流式細(xì)胞分析法對(duì)培養(yǎng)3代之后的間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)檢驗(yàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果：利用原代貼壁培養(yǎng)法后7d可得到增殖的纖維狀細(xì)胞；利用酶消化法則可以在培養(yǎng)后5d得到增殖的細(xì)胞。兩種方法獲得的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)呈梭狀，生長(zhǎng)方式為螺旋狀、細(xì)胞核較大。免疫表型中CD29陽(yáng)性率可達(dá)95.28%，而CD31和CD34的陽(yáng)性率則分別得到2.51%和3.38%。結(jié)論：利用酶消化法可有效提升人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外生長(zhǎng)速率，并且其生物學(xué)特性無(wú)明顯改變。

間充質(zhì)干細(xì)胞；分離培養(yǎng)方法；生物學(xué)特性

間充質(zhì)干細(xì)胞主要分布于早期胚胎的中胚層當(dāng)中，其具有較強(qiáng)的分化潛能，屬于多功能分化干細(xì)胞，并且能夠分化形成人體骨骼、肌肉、韌帶以及脂肪組織等。本文即是對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)優(yōu)化方法和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，具體如下：

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次研究所選擇的主體材料是由我市婦產(chǎn)科醫(yī)院提供的臍帶樣本，購(gòu)置的胎牛血清、膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、標(biāo)記物（CD29、CD31以及CD34）、分離液、培養(yǎng)液等，實(shí)驗(yàn)設(shè)備則主要包括高速低溫離心機(jī)、酶標(biāo)記儀、流式細(xì)胞儀等。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)提取人臍帶樣本，并將樣本放置在培養(yǎng)基上，利用含有青霉素、硫酸鏈霉素等的緩沖液對(duì)臍帶樣本進(jìn)行沖洗，充分將臍帶內(nèi)的殘留血液沖洗干凈。將臍帶內(nèi)的動(dòng)脈、靜脈以及外膜進(jìn)行剝離，然后剪碎臍帶，要求碎塊大小為1mm3[1]。采用原代貼壁培養(yǎng)法的直接將臍帶碎塊接種在培養(yǎng)瓶當(dāng)中；采用酶消化法的臍帶碎塊需要先經(jīng)過(guò)膠原酶和胰蛋白酶的消化處理后再接種，要求接種密度為每平方厘米1×106。然后將兩組培養(yǎng)瓶均放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，要求培養(yǎng)箱溫度設(shè)定在37℃，二氧化碳濃度為5%，每周更換1次培養(yǎng)液，每天均對(duì)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)臍帶組織的增殖情況進(jìn)行觀察和記錄。

待培養(yǎng)2周后，單層貼壁的增殖細(xì)胞匯合率應(yīng)接近80%，此時(shí)利用胰蛋白酶對(duì)兩種培養(yǎng)方式的細(xì)胞均進(jìn)行消化處理，開(kāi)展1：2傳代，并且在培養(yǎng)2周后進(jìn)行第3代傳代[2]。

1.2.2 流式細(xì)胞儀標(biāo)記物檢測(cè)

當(dāng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3代后，利用胰蛋白酶對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行消化處理，并將該細(xì)胞加入100ml的PBS當(dāng)中，要求濃度為1×106/ 100ml，分別記錄（加入）適量的CD29、CD31以及CD34抗體，采用避光染色的方式處理30min，最終將染色后的細(xì)胞加入到濃度為1%的多聚甲醛當(dāng)中制成重懸液，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[3]。

2 結(jié)果

2.1 兩種培養(yǎng)方法的結(jié)果

采用原代貼壁培養(yǎng)法后約7d時(shí)間能夠看到纖維狀細(xì)胞從臍帶組織的邊緣溢出，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；利用酶消化法培養(yǎng)后約3～5d即可看到纖維狀細(xì)胞從臍帶組織的邊緣溢出。在兩種體外培養(yǎng)方法傳代后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，其細(xì)胞形狀均呈梭狀，生長(zhǎng)方式為螺旋狀，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核均清晰可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)到第3待后兩種培養(yǎng)方法得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均排列緊密，待傳到第10代之后，兩種培養(yǎng)方法得到的細(xì)胞在形態(tài)上已經(jīng)沒(méi)有明顯的差異。

2.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物免疫特性分析

經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀的分析顯示，兩種培養(yǎng)方法所獲得的細(xì)胞免疫表型中CD29陽(yáng)性率可達(dá)95.28%，而CD31和CD34的陽(yáng)性率則分別得到2.51%和3.38%。

3 討論

在人體臍帶當(dāng)中共包含有兩條主動(dòng)脈、一條靜脈和外包膜組織，而這些結(jié)構(gòu)對(duì)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)具有一定的阻礙作用，采用人工方法進(jìn)行分離后不能保證這些組織完全剔除，因此需要采取分離培養(yǎng)方法。常用的分離培養(yǎng)法主要包括原代貼壁培養(yǎng)法、酶消化法等，這兩種方法在分離培養(yǎng)后均能夠獲得大量高表達(dá)的粘附分子，其中以CD29為主。其中原代貼壁培養(yǎng)法的操作比較簡(jiǎn)便，使用的試劑較少，但是相對(duì)的其分離培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，本次研究中獲得大量成熟細(xì)胞的時(shí)間為7d。而酶消化法不僅能夠有效促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的均勻生長(zhǎng)，而且還能夠?qū)δ殠系哪z原組織進(jìn)行去除，有效縮短了培養(yǎng)的時(shí)間[4]。本次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中驗(yàn)證，兩種培養(yǎng)方法傳代到第3代后細(xì)胞間沒(méi)有明顯的差異，說(shuō)明兩種體外培養(yǎng)方法均能夠?qū)崿F(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離細(xì)胞。因此，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件、所需培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行選擇，如實(shí)驗(yàn)條件有限，但不需要固定培養(yǎng)時(shí)間的可采用貼壁培養(yǎng)法，降低操作技術(shù)難度；如實(shí)驗(yàn)室條件允許，且需要快速傳代培養(yǎng)的，就需要利用酶消化法，保證培養(yǎng)時(shí)間。

[1]孫國(guó)棟，李志忠，王晶，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向成骨成脂分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，31（02）：143～147.

[2]龐榮清，何潔，李福兵，等.一種簡(jiǎn)單的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分類(lèi)培養(yǎng)方法[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2011，01（02）：30～33.

[3]何紹清，羅振宇，劉秋英，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向脂肪與成骨細(xì)胞的分化[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（14）：2492～2496.

[4]馬錫慧，馮凱，石炳毅.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究，2011，15（32）：6064～6067.

R329

A

1004-7344（2016）03-0299-01

2016-1-6

王怡（1985-），男，天津河?xùn)|人，助理工程師，本科，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞。