謝寧芳

對比微生物群落在3種常見膽結(jié)石膽汁中的差異性

謝寧芳

目的 探討常見的3種膽結(jié)石膽汁中微生物群落的差異性對比。方法 選擇3種類型膽結(jié)石患者100例作為研究對象，對其運用末端限制性片斷長度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)，并對其膽汁細菌群落進行基因序列分析探討。結(jié)果 （1）細菌16 Sr DNA基因片段的陽性檢出率為76%，3組之間陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義；（2）3組細菌16 Sr DNA基因片段分析，純膽固醇組的細菌群落主要以肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌為主；膽色素結(jié)石組主要包括普通變形桿菌#厭氧消化球菌等；混合性結(jié)石膽汁組主要為厭氧消化球菌/丙酸桿菌，其中還包括了膽色素結(jié)石膽汁組中未檢測到的黃微桿菌和希氏短桿菌。結(jié)論 膽結(jié)石患者膽汁標本中細菌檢出率較高，但各組細菌群落構(gòu)成各有不同，且成分較為復雜。

微生物群落；膽結(jié)石；差異性

近年來，我國的膽結(jié)石發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，目前約為5.6%[1]，就其發(fā)生機制方面來看，已然從膽汁郁滯、肺道感染及膽汁理化性質(zhì)紊亂發(fā)展為了膽囊內(nèi)微生物環(huán)境的改變[2]，基于此，本研究選擇3種類型膽結(jié)石（即：混合性結(jié)石、純膽固醇結(jié)石以及膽色素結(jié)石）患者，并利用末端限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)對患者的膽囊內(nèi)微生物菌落16 Sr DNA進行了統(tǒng)一分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河南省長葛市人民醫(yī)院2011年3月～2013年3月收治的100例3種類型膽結(jié)石患者為研究對象，其均接受擇期膽囊切除術(shù)，其中男36例，女64例，患者平均年齡（55.0±5.5）歲，本院結(jié)合對膽石化學成分用紅外光譜法的分析，將患者分為3組，分別為混合性結(jié)石組28例，純膽固醇結(jié)石組50例，膽色素結(jié)石組22例。

1.2 主要儀器和試劑 為了提高實驗的準確性，用了ABI 3100全自動遺傳分析儀、ABI 2720 PCR熱循環(huán)儀、ZF型紫外分析儀以及低溫高速臺式離心機MR 23 i等，Hi－Di甲酰胺，Liz 500和細菌16 Sr DNA PCR擴增試劑盒。

1.3 檢測方法

1.3.1 膽汁DNA的提取 研究中，取膽汁1 mL與1 mL Buffer I，并渦旋振蕩充分混勻，在此基礎(chǔ)上，加入溶菌酶（50 g/ L）100 μL，在37℃下培育1 h，并將離心管置于液氮中5 min，繼而迅速向水浴鍋（65℃）轉(zhuǎn)移，進行3 min解凍，進行反復3次，接下來加0.5 mL bufferⅡ，上下?lián)u勻后，向其中加蛋白酶K共5 μL，進行1 h水浴。完成上述操作后，按照1∶1比例向上述溶液中加入比例為25∶24∶1的加酚/氯仿/異戊醇混合液，離心5 min，用1個滅菌塑料離心管吸上層水相800 μL，并將上述3種的混合液進行等體積加入，加入2倍體積的無水乙醇，離心30 min，13 000 r/min，繼而將上清去棄去，進行真空干燥后，將30～50 μLTE緩沖溶液加入其中，對DNA進行充分溶解，并保存于-20℃的條件下。

1.3.2 T－RFLP分析 在此環(huán)節(jié)，本院研究人員將0.2 μL的Liz 500、10 μL Hi－Di甲酰胺與純化、酶切后的PCR產(chǎn)物進行混合，繼而于ABI 3130遺傳分析儀中實施毛細管電泳，所取基線的熒光強度50 RFU，并對大于基線的峰高和出峰處的T－RF長度用Genemapper軟件進行計算，標準化處理> 50 bp的峰面積，對其豐度進行計算，完善整個過程。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用了SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，率的比較采用Fisher's Exact test分析來進行，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

研究統(tǒng)計結(jié)果顯示，參與研究的100例患者中，檢出細菌16 Sr DNA基因片段的有76例，所以其對應(yīng)的陽性率為76%，3組中純膽固醇結(jié)石膽汁組陽性檢出率為80%，混合性結(jié)石膽汁組為78.5%（22/28），膽色素結(jié)石膽汁組為63.6%（14/22），3組陽性檢測率比較差異無統(tǒng)計學意義。本次研究中，在膽汁細菌16 Sr DNA PCR的T－RFLP分析方面。較高的是膽結(jié)石患者膽汁標本中的細菌，但各組細菌群落構(gòu)成各有不同，具有較為復雜的成分。

3 討論

一般情況下，可劃分膽汁檢測細菌為兩大類，即：厭氧菌與需氧菌[3]。其中需氧菌從菌株上主要是大腸桿菌，厭氧菌從菌株上主要是丙酸桿菌、消化球菌和類桿菌等。通過測定細菌DNA序列，結(jié)果顯示，純膽固醇結(jié)石膽汁組患者細菌群落相對較為單一，主要是需氧菌。膽色素結(jié)石膽汁組與混合性結(jié)石膽汁組具有相對比較豐富的細菌群落，一方面存在需氧菌，同時還存在大量厭氧菌[4-5]。本次研究中，對于膽囊結(jié)石患者體內(nèi)的膽汁標本，運用PCR技術(shù)進行了16 Sr RNA基因片段擴增，其不同于常規(guī)細菌培養(yǎng)分析，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢，能檢出1個細胞或1個細菌存在的單拷貝基因，并能結(jié)合細菌染色體上16 Sr RNA這種最保守的基因序列設(shè)計引物，使得從膽汁提取的DNA中特異性能對16 Sr RNA基因片段進行的有效擴增，從后續(xù)的實驗統(tǒng)計及分析來看，100例膽汁標本中，檢出細菌16 Sr DNA基因片段的達到了76例，檢出率達76%，這一結(jié)果與以前的相關(guān)研究一致[6-7]，相比于膽色素組及混合性結(jié)石組，純膽固醇結(jié)石組中膽汁細菌陽性率更高，但3組細菌的陽性檢測率間的差異比較不具統(tǒng)計學意義，經(jīng)后續(xù)研究來看，可能是因患者有反復慢性膽囊炎發(fā)作病史所致，使得其對應(yīng)的細菌陽性率較高。

厭氧菌和需氧菌是膽汁檢測細菌的兩大分類，前者從菌株上主要由丙酸桿菌、消化球菌等組成，后者則是以大腸桿菌為主，序列測定細菌的DNA后，統(tǒng)計分析顯示，純膽固醇結(jié)石膽汁組存在單一細菌群落，深入研究后發(fā)現(xiàn)[8-9]，其以需氧菌為主，此組外的兩組，也就是混合性結(jié)石膽汁組、膽色素結(jié)石膽汁組與前組不同，其具有豐富的細菌群落，厭氧菌及需氧菌都有，本研究未測出耐膽汁酸鹽菌株序列，可能與該菌在膽囊中數(shù)量過低等有關(guān)。

綜上，據(jù)本院統(tǒng)計分析看來，就檢出率方面來看，膽結(jié)石患者膽汁標本中細菌檢出率較高，但各組細菌群落構(gòu)成各有不同，且成分較為復雜。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.31.026

河南 461500 河南省長葛市人民醫(yī)院檢驗科 （謝寧芳）