馮芳萍

(山西省呂梁市離石區(qū)農(nóng)委畜牧獸醫(yī)技術(shù)站，山西 呂梁 033000)

雞新城疫病毒的分離和鑒定

馮芳萍

(山西省呂梁市離石區(qū)農(nóng)委畜牧獸醫(yī)技術(shù)站，山西 呂梁 033000)

旨在為發(fā)病雞場(chǎng)找到致病原，本研究利用SPF雞胚從發(fā)病雞組織中分離到1株病毒，病毒對(duì)1%雞紅細(xì)胞的血凝價(jià)為28，病毒的ELD50為107.83/0.1 mL，病毒可以被新城疫病毒陽(yáng)性血清特異性中和，攻擊該病毒的SPF雞表現(xiàn)出典型的新城疫病毒感染癥狀，RT-PCR鑒定顯示該病毒為新城疫病毒。

雞新城疫病毒；分離；鑒定

雞新城疫（Newcastledisease，ND）又稱(chēng)亞洲雞瘟，是由雞新城疫病毒（Newcastle diseasevirus，NDV）引起禽類(lèi)的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為主要病變特征的急性、敗血性、高度接觸性傳染病[1]。近年來(lái)隨著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，新城疫免疫失敗顯現(xiàn)不斷增加，新城疫成為目前規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)最容易發(fā)生的病毒性傳染病之一。本研究對(duì)臨床表現(xiàn)為全身黏膜和漿膜出血、腸道淋巴結(jié)腫脹出血、腺胃黏膜水腫、乳頭出血、氣管有出血和壞死的疑似新城疫病毒感染病例進(jìn)行病毒的分離與鑒定，為發(fā)病雞場(chǎng)找到致病原和制定綜合防治措施提供了參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 雞胚、雞、血清

10日齡SPF雞胚、2月齡SPF雞均購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；新城疫病毒陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 病料樣品的采集與處理

無(wú)菌采取病死雞的氣管、淋巴結(jié)等組織病料按1：3加入生理鹽水，用研磨器反復(fù)研磨，12 000 r/min離心10 min，取上清液依次加入終濃度分別為2 000 IU/mL的青霉素、鏈霉素和卡那霉素，置于4℃放置6 h，即得處理后的病料樣品。

1.3 病毒分離傳代

將處理后的病料樣品接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2 mL/胚，棄去24 h死亡的雞胚，收集24 h之后死亡的雞胚尿囊液，傳3代，收集每一代的死亡雞胚尿囊液，取第3代病毒尿囊液做下面的毒株鑒定。

1.4 分離毒株血凝性測(cè)定

按照常規(guī)血凝實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定第3代分離毒對(duì)1%雞紅細(xì)胞的凝集性。

1.5 分離毒株雞胚半數(shù)致死量（ELD50）的測(cè)定

將第3代病毒尿囊液做10倍系列稀釋?zhuān)?0-6，10-7，10-8三個(gè)稀釋度分別接10日齡SPF雞胚5枚，棄去24h死亡的雞胚，記錄接種后24 h死亡且胎兒病痕明顯的雞胚，按Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.6 中和試驗(yàn)

將第3代病毒尿囊液與等量新城疫病毒陽(yáng)性血清混合，室溫中和1 h后，接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2 mL/胚，棄去24 h死亡的雞胚，觀察雞胚死亡情況，至120 h，取所有活胚尿囊液做凝集實(shí)驗(yàn)。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將分離的第3代病毒接種健康2月齡SPF雞10只，每只雞氣管內(nèi)注射0.1mL，觀察接種后雞的發(fā)病情況。

1.8 RT-PCR鑒定

將分離的第3代病毒按照參考文獻(xiàn)[3]的方法提取病毒基因組RNA，并按照文獻(xiàn)[2]中的RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與胚體病變觀察結(jié)果

雞胚接種病料樣品后48 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，一般在72～96 h死亡較多，取死亡雞胚剖檢可見(jiàn)全身有出血點(diǎn)，雞胚縮小，發(fā)育不良。

2.2 血凝性的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)血凝實(shí)驗(yàn)，測(cè)定第3代分離毒的血凝價(jià)為28。

2.3 ELD50的測(cè)定結(jié)果

第3代分離毒的ELD50為107.83/0.1 mL。

2.4 中和試驗(yàn)結(jié)果

第3代分離毒與新城疫陽(yáng)性血清中和后，接種10日齡SPF雞胚10枚全部健活，活胚尿囊液對(duì)1%雞紅細(xì)胞無(wú)凝集性，說(shuō)明分離毒株可以被新城疫病毒陽(yáng)性血清特異性中和。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

第3代分離毒接種健康SPF雞后，接種第3 d開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病雞食欲下降，精神萎靡，翅下垂，眼半閉半睜，后期出現(xiàn)咳嗽和呼吸困難，5 d后全部死亡。剖檢死亡雞可見(jiàn)全身出血，消化道和呼吸道出血明顯。

2.6 RT-PCR鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，在511 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物為新城疫病毒的特異性序列，分離毒株為新城疫病毒。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)現(xiàn)地感染的病雞病變組織處理后接種10日齡SPF雞胚，通過(guò)對(duì)分離毒進(jìn)行血凝性，中和試驗(yàn)，ELD50測(cè)定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)及RT-PCR檢測(cè)，最終確定雞場(chǎng)感染新城疫病毒，為發(fā)病雞場(chǎng)找到致病原及綜合防制奠定了基礎(chǔ)。新城疫病毒是家禽最常見(jiàn)的病毒性傳染病，各種家禽普遍易感，各種年齡雞都可感染，幼雞和雛雞更易感。本病春秋兩季高發(fā)，雞群一旦發(fā)生強(qiáng)毒感染，一般很難凈化。新城疫的防治主要通過(guò)疫苗免疫接種，制定科學(xué)合理的免疫程序?qū)π鲁且叩姆揽刂陵P(guān)重要。免疫雞群也可以發(fā)生新城疫病毒感染，往往由于母源抗體干擾免疫效果導(dǎo)致免疫失敗[3]，因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫時(shí)機(jī)，避開(kāi)母源抗體高峰期，一般可以對(duì)雞群的母源抗體效價(jià)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如果抗體效價(jià)高于25則不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在23的時(shí)候免疫接種可以產(chǎn)生良好的免疫效果。平時(shí)需要做好養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，保持雞舍的溫度，通風(fēng)良好，一旦發(fā)生患病雞要及時(shí)隔離。此外，防治新城疫要采取嚴(yán)格的生物安全措施，加強(qiáng)引種方面的監(jiān)管，防止新城疫強(qiáng)毒進(jìn)入家禽群，做好定期的免疫接種工作，提高禽群特異性免疫效果。

[1]肖華平,黃忍,魏培,等.新城疫病毒的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32(4)：43，87.

[2]梁瑾,程福亮,陳甜甜,等.新城疫病毒一步法RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2013,26（2）：265-267.

[3]劉孝霖,馬金松,劉學(xué)洪.雞新城疫免疫失敗的原因及對(duì)策[J].當(dāng)代畜牧,2016（1）：8-9.

(編輯：張淑鳳)

S852.659.5

B

1006-799X(2016)21-0095-01

馮芳萍（1968-），女，山西呂梁人，獸醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樾竽莲F醫(yī)。