燕曉曉，王 軍，呂文發(fā)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林長春 130118)

LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞TLR4信號傳導(dǎo)通路研究概況

燕曉曉，王 軍，呂文發(fā)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林長春 130118)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后細(xì)菌感染子宮而引起的產(chǎn)科疾病，嚴(yán)重影響奶牛業(yè)的健康發(fā)展。革蘭陰性細(xì)菌中的大腸埃希菌是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌，細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成成分，也是近年研究奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病機(jī)制的重要誘導(dǎo)物。論文綜述了LPS、Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)及炎性因子，初步剖析了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路TLR4信號通路，為奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究提供參考。

奶牛子宮內(nèi)膜炎；LPS；TLR4信號通路；炎性因子

微生物感染生殖道將誘發(fā)一系列與動物生殖相關(guān)的疾病，其中，奶牛子宮內(nèi)膜炎可引發(fā)母牛不孕、流產(chǎn)甚至死亡[1-2]，嚴(yán)重制約奶牛業(yè)的健康發(fā)展。先天性免疫作為子宮內(nèi)膜的主要免疫方式，在子宮腔受到外來微生物感染時(shí)，通過抑制微生物對細(xì)胞和組織的損傷活動來減少微生物對機(jī)體的傷害。近些年研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜先天性免疫反應(yīng)的發(fā)生主要通過TLR4信號通路[3]，而LPS作為TLR4信號通路的主要啟動因子[4]，同時(shí)也是奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌-大腸埃希菌的內(nèi)毒素，可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子[5],以此建立奶牛子宮內(nèi)膜炎的體外模型。因此，解析LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制，對闡明奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型治療藥物具有重要意義。本文從LPS、TLRs、炎性因子方面綜述了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路——TLR4信號通路。

1 LPS

LPS作為大腸埃希菌等革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成成分，是目前已知的與動物先天性免疫系統(tǒng)相關(guān)的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)[6-7]，近年來人們研究LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞mRNA和蛋白的表達(dá)變化，從細(xì)胞水平探究子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)制。LPS可激活奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞TLR信號通路，提高信號分子及下游炎性介質(zhì)的表達(dá)。Fu Y H等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理上皮細(xì)胞后TLR4和TLR2的蛋白及mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，且在第3 h和第6 h時(shí)，髓樣細(xì)胞分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)、轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB、致炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、IL-6的mRNA表達(dá)量都有顯著增加。LPS處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系后，IL-6、趨化因子CXCL1、CCL20和前列腺素E(PGE)的mRNA表達(dá)量都有顯著增加，且具有作用時(shí)間和LPS濃度依賴性的特點(diǎn)[9]。此外，細(xì)胞受LPS刺激后釋放的抗菌肽可以加快機(jī)體對入侵病原菌的清除速度，如抗菌肽家族中的一個(gè)主要成員-防御素β可以通過刺穿細(xì)菌細(xì)胞壁來消滅入侵病原菌。以上研究均表明，LPS是奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞先天性免疫反應(yīng)的PAMPs，誘發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎。

2 TLRs

TLRs是一個(gè)進(jìn)化保守的模式識別受體家族，它在先天性免疫激活過程中起到不可或缺的作用[10]。TLRs家族成員在哺乳動物中有著非常廣泛的表達(dá)，且其家族中各個(gè)成員可分別識別不同微生物PAMPs的刺激，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識別微生物是否為異體物質(zhì)。目前已知的TLRs天然配體多為真菌、細(xì)菌或病毒等微生物的組成部分[11]：如TLR1、TLR2和TLR6識別細(xì)菌的脂質(zhì)和脂磷壁酸(LTA)；TLR3、TLR7和TLR8識別病毒的核酸，TLR9可識別細(xì)菌和病毒的核酸；TLR4識別革蘭陰性細(xì)菌的LPS；TLR5結(jié)合鞭毛蛋白。

2.1 LPS和TLRs的關(guān)系

動物消化道和呼吸道黏膜布滿了淋巴組織，而在生殖道內(nèi)幾乎沒有，子宮內(nèi)膜為子宮免受細(xì)菌感染提供了唯一的免疫屏障，因此動物的先天性免疫對子宮內(nèi)膜炎的抵御作用十分重要[12]。先天性免疫受體能夠識別病原菌表面的序列即PAMPs來檢測異體物質(zhì)，在體外細(xì)胞模型中，LPS可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR1-7、9及基質(zhì)細(xì)胞TLR1、2、4、6、7、9、10的mRNA表達(dá)上調(diào)[13]。上述研究表明，TLRs可特異性識別LPS，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)來抵抗入侵的細(xì)菌。

LPS的特異性識別受體-TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的功能性TLR，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過TLR4/CD14/MD2復(fù)合物識別LPS，進(jìn)而激活信號通路[14]。隨后，活化的TLR4信號通路誘導(dǎo)促炎因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子和前列腺素等分泌。研究發(fā)現(xiàn)LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞24 h后，TLR4 信號分子(TLR4，CD14)的mRNA表達(dá)量有顯著提高[8]。

LPS活化TLR4后激活兩個(gè)信號通路,即髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型信號通路和MyD88不依賴型信號通路[8]。MyD88依賴型信號通路通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體包括與白介素-1受體Ⅰ型(IL-1RⅠ)相關(guān)的蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶等，最終激活NF-κB信號通路和MAPK信號通路，引起下游炎性介質(zhì)表達(dá)；有研究表明，MyD88基因敲除小鼠仍能顯著分泌炎性介質(zhì)，進(jìn)而阻止炎癥的進(jìn)一步惡化，只是炎性介質(zhì)分泌較晚[15]，說明TLR4信號通路中還存在其他抗炎途徑，即MyD88不依賴型信號通路，MyD88不依賴型信號通路借助其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體包括Toll樣受體銜接分子1(TICAM1)和Toll樣受體銜接分子2(TICAM2)等，活化轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和誘導(dǎo)干擾素β(IFN-β)的生成?；罨腡LRs在抵御入侵病原體時(shí)起到很關(guān)鍵的作用，但如果過度活化TLRs，可能會導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)的失衡進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的損傷，因此必須將TLRs的活化程度控制在一定范圍內(nèi)。Toll作用蛋白(Toll interacting protein，TOLLIP)是一種抑制TLRs信號的分子，TOLLIP通過阻止與IL-1RI相關(guān)的蛋白激酶的磷酸化，來阻斷MyD88基因依賴型信號通路的信號傳遞[16]。TOLLIP作為TLRs信號通路的負(fù)調(diào)控因子能抑制炎性介質(zhì)的分泌，同時(shí)也協(xié)調(diào)MyD88基因信號通路中細(xì)胞因子的過度表達(dá)，機(jī)體正調(diào)控TOLLIP的表達(dá)對調(diào)控炎性介質(zhì)的分泌及控制炎癥發(fā)展方向是必不可少的。

2.2 TLR4信號傳導(dǎo)通路下游因子

細(xì)菌感染奶牛子宮后激活子宮內(nèi)TLR4信號傳導(dǎo)通路，子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和前列腺素等信號通路下游因子來抵御炎癥反應(yīng)。

2.2.1 細(xì)胞因子 組織細(xì)胞分泌細(xì)胞因子可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖和損傷組織的修復(fù)等功能[17]。細(xì)胞因子主要分為：白細(xì)胞介素、趨化因子、腫瘤壞死因子超家族、生長因子和干擾素等，各個(gè)因子之間通過相互影響和作用調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能。如，細(xì)胞因子IL-1和IL-6與腫瘤壞死因子通過刺激抗菌肽的產(chǎn)生來抑制病原菌對機(jī)體的損害作用。

在動物機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)過程中，炎性反應(yīng)產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子與機(jī)體自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)分泌的促炎細(xì)胞因子之間的平衡，對炎癥的發(fā)生與消除有著非常重要的作用[18]。其中抗炎細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答過程中起到非常關(guān)鍵的作用，如IL-1有多方面的免疫作用，包括：擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和刺激應(yīng)答急性期蛋白[19]。促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-8，可以通過影響牛子宮內(nèi)膜和卵巢激素的分泌來影響動物機(jī)體的生殖能力[20]。臨床型子宮內(nèi)膜炎奶牛產(chǎn)后4、6和8周子宮內(nèi)膜促炎因子如IL10、TNF-α和IL6的表達(dá)量顯著高于隱性子宮內(nèi)膜炎及健康奶牛[21]。此外，IL-8可顯著促進(jìn)牛子宮內(nèi)中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear，PMN)的募集[22]。將抗IL-8物質(zhì)注入子宮后，PMN對子宮內(nèi)膜的損傷則減輕或停止，這一結(jié)果證明，IL-8可通過誘導(dǎo)PMN募集來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的反應(yīng)程度。

IL-6是炎癥早期的促炎細(xì)胞因子，其具有廣泛的生物活性，如介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，患病奶牛子宮內(nèi)IL-8和IL-6的分泌量顯著相關(guān)[23]，且當(dāng)炎性細(xì)胞因子應(yīng)對細(xì)菌入侵而表達(dá)量提高時(shí)，IL-6的mRNA表達(dá)量也顯著提高。提示，IL-6具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和急性期反應(yīng)的功能，并在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。

TNF-α不僅能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和自身修復(fù)功能，還可影響前列腺素的合成[24]。機(jī)體多種免疫細(xì)胞都可以分泌TNF-α，尤其是炎癥期間的PMN能分泌大量TNF-α。研究表明，隱性子宮內(nèi)膜炎奶牛(PMN>8%)子宮內(nèi)膜TNFα表達(dá)量顯著高于健康奶牛(PMN<8%)[20]。此外，TNF-α能促進(jìn)前列腺素(prostaglandin，PG)的表達(dá)量上升[25]從而降低母牛的繁殖力。綜上，TNF-α在調(diào)節(jié)炎癥、免疫應(yīng)答反應(yīng)及生理周期等重要的生理、病理過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

2.2.2 前列腺素 前列腺是是機(jī)體內(nèi)具有多種生理作用的重要激素，在動物繁殖生理周期中具有調(diào)節(jié)作用的主要是PGF和PGE。已有研究表明，LPS可顯著提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞PG的表達(dá)量[25]。臨床研究也證明，子宮內(nèi)膜炎奶牛(PMN>5%)子宮PG的表達(dá)量顯著高于健康奶牛[26]。綜上所述，子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生引起子宮內(nèi)膜細(xì)胞前列腺素表達(dá)量的改變，而前列腺素是黃體溶解過程中的重要激素，因此前列腺素在子宮內(nèi)膜炎發(fā)生時(shí)對機(jī)體生理周期的調(diào)節(jié)，對機(jī)體抵御炎癥反應(yīng)十分重要。

2.2.3 其他因子 除上述因子外，當(dāng)細(xì)菌侵入子宮時(shí)，抗菌肽(LAP、S100A8、S100A9、S100A12)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP13)、一氧化氮合酶2(NOS2)等因子mRNA的表達(dá)量也會有所改變。

3 結(jié)語

綜上所述，人們利用LPS刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞誘發(fā)TLR4的活化，正調(diào)控MyD88依賴型信號通路和MyD88不依賴型信號通路炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，以此作為體外模型研究奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)制。由于LPS激活TLR4信號通路及其下游因子分泌機(jī)制和因子之間的相互作用是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、代謝利用途徑、基因表達(dá)及免疫調(diào)控，故在今后的研究中應(yīng)著力于上述生物過程的發(fā)生機(jī)制及彼此之間的相互作用，將能更好地解析奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)制，為奶牛子宮內(nèi)膜炎的防控提供理論依據(jù)。

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LPS Induced TLR4 Signaling Pathway in Bovine Endometrial Cells

YAN Xiao-xiao，WANG Jun，LYU Wen-fa

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Chagnchun，Jilin，130118,China)

Postpartum endometritis in cattle is an obstetric disease caused by bacterial infection, which is of economic importance since it negatively impacts on the dairy industry. Gram negative bacteriumEscherichiacoliis the main pathogen currently known to cause cow endometritis,and bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major component of the cell wall of Gram negative bacteria and recently also reported as an important inducer of cow endometritis pathogenesis. This paper reviewed the LPS Toll-like receptors(TLRs) and inflammatory factors as well as preliminary analysis of the LPS induced inflammatory response signaling pathway -TLR4 signaling pathway in order to provide reference for the study of cow endometritis.

cow endometritis; LPS; TLR4 signaling pathway; inflammatory factor

2016-04-08

吉林省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140203016NY)；吉林省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(20150204074NY)；吉林省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(20150519018JH)

燕曉曉(1990-)，女，河南博愛人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。 *通訊作者

S857.22

A

1007-5038(2016)12-0105-04