王婷婷，周 瑞（1.連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇連云港 006；.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇連云港 006）

骨肽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

王婷婷1＊，周 瑞2（1.連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇連云港 222006；2.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇連云港 222006）

目的：建立骨肽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。方法：依據(jù)2015年版《中國藥典》“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下凝膠法的要求，通過干擾試驗(yàn)確定樣品主成分最大無干擾質(zhì)量濃度，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：樣品主成分質(zhì)量濃度稀釋至0.333 mg/ml或以下時(shí)對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無干擾作用。結(jié)論：所建立的方法可用于骨肽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

骨肽注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；凝膠法；干擾試驗(yàn)

骨肽注射液是由新鮮或冷凍的豬或胎牛四肢骨提取制成，在臨床上主要用于促進(jìn)骨折的愈合，也用于增生性骨關(guān)節(jié)疾病及風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的輔助治療[1]。該制劑目前執(zhí)行的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中所采用的熱原檢查法易受家兔自身因素干擾而出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果[2-3]。為了提高該制劑的質(zhì)量控制水平，筆者依據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下凝膠法的要求[4]，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]對骨肽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器

MET-50型智能恒溫加熱儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨肽注射液（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號：150208、150504、150652，規(guī)格：2 ml：10 mg）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201478，規(guī)格：80 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，中國食品藥品檢定研究院，批號：160006-201401，規(guī)格：5 ml/支）；鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：1501071、標(biāo)示靈敏度：0.25 EU/ml，批號：1503101、標(biāo)示靈敏度：0.125 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號：1502021、標(biāo)示靈敏度：0.25 EU/ml，批號：1505041、標(biāo)示靈敏度：0.125 EU/ml）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L＝K/M[4]計(jì)算L。式中，K為人每kg體質(zhì)量在1 h內(nèi)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人用每kg體質(zhì)量在1 h內(nèi)最大樣品劑量，根據(jù)樣品說明書靜脈滴注1次最大劑量為20 ml，我國人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)，滴注時(shí)間按1 h計(jì)（不足1 h的仍按1 h計(jì)），故M＝20 ml/（60 kg·1 h）＝0.333 ml/（kg·h）。則L＝5 EU/（kg· h）/0.333 ml/（kg·h）＝15 EU/ml。因此，本研究擬定骨肽注射液的L為每1 ml該制劑中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)＜15 EU。

2.2 干擾試驗(yàn)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD＝c·L/λ[4]計(jì)算MVD。式中，L＝15 EU/ml；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c＝1.0 ml/ml；λ為TAL的標(biāo)示靈敏度（《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[5]建議干擾試驗(yàn)使用0.5 EU/ml或0.25 EU/ml的TAL，本試驗(yàn)選擇λ＝0.25 EU/ml的TAL，而進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)選擇λ值較低的TAL），MVD＝（1.0 ml/ml·15 EU/ml）/0.25 EU/ml＝60。

2.3 TAL靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，配制成2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ的溶液，按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143[4]方法操作，以BET水做2支陰性對照管（NC），對2個(gè)廠家生產(chǎn)的TAL進(jìn)行λ復(fù)核。結(jié)果，4批TAL復(fù)核靈敏度均在0.5λ～2.0 λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定，詳見表1（注：“+”表示陽性反應(yīng)，“－”表示陰性反應(yīng)，下表同）。

表1 TAL的λ復(fù)核結(jié)果Tab 1 Recheck results of TAL

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

取1支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 ml的BET水溶解，混勻后備用。取3批樣品各1瓶，用BET水分別稀釋2、4、8、15、30倍作為供試品陰性對照系列溶液（NPC）；同時(shí)，每一稀釋倍數(shù)下制備供試品陽性對照系列溶液（PPC，即用該濃度的供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備成2.0 λ濃度）。用λ＝0.25 EU/ml的2個(gè)廠家生產(chǎn)的TAL分別與上述2種系列溶液反應(yīng)，每一稀釋倍數(shù)平行做2支管。另取2支管加入BET水作為陰性對照（NC），2支管加入2.0 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照（PC）。取以上4種溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of interference pretest of samples

由表2可見，3批樣品均分別稀釋15倍后，對2個(gè)廠家生產(chǎn)的λ＝0.25 EU/ml的TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無干擾作用。

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取3批樣品用BET水分別稀釋15倍后作為供試品溶液；用供試品溶液和BET水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml的系列溶液，每個(gè)濃度平行做4支管，分別與2個(gè)廠家生產(chǎn)的λ＝0.25 EU/ml的TAL反應(yīng)。另取供試品溶液和BET水做2支陰性對照管（NC），參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-8]進(jìn)行干擾試驗(yàn)，按公式Es＝lg－1（∑Xs/4）和Et＝lg－1（∑Xt/4）[式中，Es為用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Et為用供試品溶液或稀釋液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Xs、Xt分別為用BET水和供試品溶液或稀釋液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素（標(biāo)準(zhǔn)）溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）][5]計(jì)算各系列溶液反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的絕對值，結(jié)果見表3。

表3 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of interference test of samples

由表3可見，Es均在0.5 λ～2.0 λ范圍內(nèi)，且Et均在0.5 Es～ 2.0 Es范圍內(nèi)，表明樣品稀釋15倍后對TAL（λ＝0.25 EU/ml）與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無干擾作用，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批樣品各1瓶，分別用BET水稀釋15倍（主成分質(zhì)量濃度為0.333 mg/ml），使用λ＝0.125 EU/ml的2個(gè)廠家生產(chǎn)的TAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并按相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]方法做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表4。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacterial endotoxins test of samples

3 討論

骨肽注射液是復(fù)方制劑，其主要成分是多肽類物質(zhì)、有機(jī)鈣、磷、無機(jī)鈣、無機(jī)鹽、微量元素等。在建立骨肽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法時(shí)，首先通過干擾預(yù)試驗(yàn)評價(jià)該制劑對TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度，初步篩選出對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的樣品主成分質(zhì)量濃度范圍。最終的干擾試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果表明，該制劑主成分質(zhì)量濃度稀釋至0.333 mg/ml或以下時(shí)，對TAL（λ＝0.125 EU/ml）與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)未見干擾作用，即該制劑采用L＝15 EU/ml進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

本試驗(yàn)采用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法相比于家兔熱原檢查法具有簡便經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適合于骨肽注射液生產(chǎn)和流通中的快速質(zhì)量控制。而本試驗(yàn)的結(jié)果可為該制劑在新版的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中將家兔熱原檢查法修訂為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 王常禹，岳云飛，牛惠玲，等.骨肽注射液質(zhì)量分析及研究[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2 197.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-035-2000[S].2003.

[3] 田祥學(xué).細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥指南，2015（23）：278.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：154-157.

[5] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310-325.

[6] 丁秀旻.骨肽注射液中細(xì)菌內(nèi)毒定量檢查研究[J].海峽藥學(xué)，2007，19（12）：62.

[7] 張娟，祝清芬，范治云，等.氫溴酸山茛菪堿注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J].中國藥房，2014，25（45）：4 285.

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（編輯：周 箐）

Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method for Ossotide Injection

WANG Tingting1，ZHOU Rui2（1.Lianyungang Institute for Drug Control，Jiangsu Lianyungang 222006，China；2.Chia-tai Tianqing Pharmaceutical Co.Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222006，China）

OBJECTIVE：To establish the bacterial endotoxin test method of Ossotide injection.METHODS：According to the appendix of the gel method under“bacterial endotoxin test method”in Chinese Pharmacopiea（2015 edition），the maximal non-interference concentrations of samples were determined by interference test，and then methodology validation was conducted.RESULTS：The agglutination of LAL with bacterial endotoxin had no interference when the sample was diluted to 0.333 mg/ml or below.CONCLUSIONS：The established method can be used to detect the bacterial endotoxin of Ossotide injection.

Ossotide injection；Bacterial endotoxin test；Gel method；Interference test

R927

A

1001-0408（2016）36-5151-02

2015-12-30

2016-10-28）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：124603079@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.35