常志惠，胡軍華，萬亞菲，孫雷雷，王鈾生（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港00；.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 000；.南京博大腎科醫(yī)院，南京 0000）

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定保腎乙丸中5種蒽醌類成分的含量

常志惠1＊，胡軍華2，萬亞菲1，孫雷雷3，王鈾生3（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港222002；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222000；3.南京博大腎科醫(yī)院，南京 210000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定保腎乙丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以大黃素為基準(zhǔn)峰，分別計(jì)算其與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的相對(duì)校正因子（RCF），通過RCF計(jì)算保腎乙丸中上述5種蒽醌類成分的含量。色譜柱為Waters Symmetry C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為5.83～186.6 μg/ml（r＝0.999 7）、9.39～300.5 μg/ml（r＝0.999 5）、9.55～305.6 μg/ml（r＝0.999 9）、10.23～327.4 μg/ml（r＝0.999 9）、4.01～128.4μg/ml（r＝0.999 4）；定量限分別為364.4、880.2、596.9、319.7、501.3 ng，檢測(cè)限分別為109.3、293.4、179.1、95.91、150.4 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.38%～100.90%（RSD＝1.62%，n＝6）、97.72%～101.75%（RSD＝1.44%，n＝6）、97.66%～102.34%（RSD＝1.63%，n＝6）、97.33%～101.91%（RSD＝1.75%，n＝6）、97.78%～100.74%（RSD＝1.19%，n＝6）。大黃素與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚間的RCF分別為1.217 7、1.153 4、1.424 2、1.034 5。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便快捷，可用于同時(shí)測(cè)定保腎乙丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分的含量。

保腎乙丸；一測(cè)多評(píng)法；蒽醌類成分；高效液相色譜法

保腎乙丸是在臨床治療經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)選的組方，具有補(bǔ)腎健脾、活血和絡(luò)、泄?jié)崂墓π?，主治慢性腎臟病所致的慢性腎衰竭（代償期、失代償期和衰竭期）非透析患者、氣陰兩虛兼濕濁證患者出現(xiàn)的面黃乏力、食少納呆、口干腰酸、大便干結(jié)、下肢水腫等，具有保護(hù)腎功能，降血肌酐、血尿素氮、血尿酸、尿蛋白，消水腫等作用。該處方主要由菟絲子、何首烏、黃芪、懷牛膝、大黃、陳皮等中藥材組成，其中君藥何首烏的主要成分為蒽醌類成分，使藥大黃的主要成分亦為蒽醌類成分。蒽醌類成分具有多種生理活性，主要表現(xiàn)在降血糖、降膽固醇、利尿通便、抗氧化和抗衰老等方面。蒽醌類成分主要包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等，目前對(duì)該類成分的測(cè)定多采用外標(biāo)法（ESM），所需對(duì)照品繁雜，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，本研究采用一測(cè)多評(píng)法（QAMS）[1-4]建立了同時(shí)測(cè)定保腎乙丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的方法，旨在為保腎乙丸的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀，包括MWD紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；AE-240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

保腎乙丸（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：120905、120906、120907、120909、131001、131002、131003、141201、141202、141203，規(guī)格：6 g/瓶）；蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201007，純度：98.0%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206，純度：100%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201410，純度：100%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201017，純度：99.5%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013，純度：99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原理

在一定范圍內(nèi)成分的量（質(zhì)量或濃度）與儀器響應(yīng)值成正比，即：f＝W/A（f表示相對(duì)校正因子，W表示成分的量，A表示儀器響應(yīng)值）。在對(duì)保腎乙丸中5種蒽醌類成分進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，以大黃素（s）為內(nèi)參物，建立大黃素（s）與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚之間的相對(duì)校正因子（RCF）：

式中，fsx代表內(nèi)參物與待測(cè)成分之間的成分RCF；Cs、Cx分別代表內(nèi)參物與待測(cè)物成分濃度；As、Ax分別代表內(nèi)參物與待測(cè)成分的儀器響應(yīng)值。

通過RCF計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的量，同時(shí)采用ESM法計(jì)算上述成分的量：

式中，AE代表待測(cè)成分的儀器響應(yīng)值；a、b分別代表本公式的斜率和截距；CE代表ESM法計(jì)算所得待測(cè)成分的濃度進(jìn)行同步測(cè)定，以驗(yàn)證計(jì)算值的準(zhǔn)確性和可行性[5-8]。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30Ⅱ；進(jìn)樣量：10 μl。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，置于同一100 ml量瓶中，加甲醇制成1 ml含蘆薈大黃素40 μg、大黃酸60 μg、大黃素60 μg、大黃酚60 μg、大黃素甲醚25 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置于250 ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.5 mol/L的硫酸溶液25 ml，微熱使溶解，加三氯甲烷40 ml，水浴回流1 h，分取三氯甲烷層，剩余溶液再加三氯甲烷萃取3次，每次20 ml，合并上述三氯甲烷液，水洗至中性，回收三氯甲烷，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍ㄈ葜?0 ml量瓶中，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備缺何首烏和大黃的陰性樣品，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以大黃素峰計(jì)為19 872，保留時(shí)間為23.478 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.aloe emodine；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品各適量，置于同一50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得各待測(cè)成分質(zhì)量濃度分別均為186.6、300.5、305.6、327.4、128.4μg/ml的系列混合對(duì)照品溶液。取上述系性溶液各適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄信噪比。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的LOQ分別為364.4、880.2、596.9、319.7、501.3 ng；LOD分別為109.3、293.4、179.1、95.9、150.4 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.13%、1.12%、0.51%、0.73%、0.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：120905）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.75%、1.11%、0.83%、0.95%、1.57%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：120905）2.5 g，精密稱定，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.18、0.46、0.35、0.21、0.11 mg/g，RSD分別為1.24%、0.71%、1.12%、1.08%、1.64%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：120905）6份，每份1.25 g，分別置于250 ml錐形瓶中，精密加入一定質(zhì)量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

續(xù)表2Continued tab 2

2.11 RCF的計(jì)算和待測(cè)成分色譜峰的定位

以大黃素為內(nèi)參物，按“2.1”項(xiàng)下公式（1），結(jié)合“2.5”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計(jì)算大黃素與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RCF。結(jié)果，大黃素與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RCF分別為1.217 7、1.153 4、1.424 2、1.034 5。

利用色譜峰相對(duì)保留值（其他成分保留時(shí)間與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值）定位：由色譜峰相對(duì)保留值和內(nèi)參物的保留時(shí)間計(jì)算出目標(biāo)峰相對(duì)保留時(shí)間，再根據(jù)峰形及光譜吸收變化趨勢(shì)，即能夠在一定程度上準(zhǔn)確判斷目標(biāo)峰的位置。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.75%、0.60%、0.45%、0.44%（n＝5），表明利用色譜峰相對(duì)保留值進(jìn)行目標(biāo)峰的定位是可行的。

2.12 RCF的耐用性考察

本試驗(yàn)考察了不同色譜柱（Waters Symmetry C18、Kromasil C18、Phenomenex Luna C18）、不同儀器（Aglient 1200、Aglient 1260、Waters 2695）、不同柱溫（25、28、30、32、35Ⅱ）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）對(duì)蒽醌類成分含量測(cè)定結(jié)果的影響及對(duì)RCF和相對(duì)保留值的影響。結(jié)果，不同色譜柱、儀器、柱溫、流速下測(cè)定的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.35%、2.14%、0.37%、1.68%、0.85%；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚RCF的RSD分別為2.14%、1.71%、1.23%、1.46%，相對(duì)保留值的RSD分別為1.89%、2.79%、2.31%、2.10%。結(jié)果表明，不同色譜柱、儀器、柱溫、流速對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RCF無明顯影響。

2.13 樣品含量測(cè)定

取10批樣品各適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并分別采用ESM法和QAMS法測(cè)定保腎乙丸中5種蒽醌類成分的含量[相對(duì)誤差（RE）＝（QAMS法測(cè)得含量－ESM法測(cè)得含量）/ESM法測(cè)得含量×100%]，結(jié)果見表3。

3 討論

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝2，mg/g）

本研究選用性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得的大黃素為內(nèi)參物，建立了該成分與其他4種蒽醌類成分的RCF，分別采用ESM法與QAMS法測(cè)定10批保腎乙丸中5種蒽醌類成分的含量。結(jié)果表明，ESM法測(cè)定結(jié)果與QAMS法測(cè)定結(jié)果無顯著差異，說明QAMS法能夠準(zhǔn)確測(cè)定保腎乙丸中5種蒽醌類成分的含量。同時(shí)，QAMS法所用對(duì)照品種類較少，操作簡(jiǎn)單、方便，具有實(shí)用價(jià)值。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便快捷，可用于同時(shí)測(cè)定保腎乙丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分的含量。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 5Anthraquinones in Baoshenyi Pill by QAMS

CHANG Zhihui1，HU Junhua2，WAN Yafei1，SUN Leilei3，WANG Yousheng3（1.Dept.of Pharmacy，Lianyungang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Lianyungang 222002，China；2.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222000，China；3.Nanjing Boda Nephrological Hospital，Nanjing 210000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 5 anthraquinones（aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion）in Baoshenyi pill.METHODS：HPLC was conducted，using emodin as reference peak，the relative correction factors（RCFS）between emodin and aloe emodin，rhein，chrysophanol and physcion were calculated to calculate the contents of above-mentioned 5 anthraquinones.The column was Waters Symmetry C18with mobile phase of methanol-0.1% phosphoric acid solution（70∶30，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，column temperature was 30Ⅱand injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 5.83-186.6μg/ml for aloe emodine（r＝0.999 7），9.39-300.5μg/ml for rhein（r＝0.999 5），9.55-305.6μg/ml for emodin（r＝0.999 9），10.23-327.4μg/ml for chrysophanol（r＝0.999 9）and 4.01-128.4μg/ml physcion（r＝0.999 4）；the limits of quantification were 364.4，880.2，596.9，319.7，501.3 ng，limits of detection were 109.3，293.4，179.1，95.9，150.4 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.38%-100.90%（RSD＝1.62%，n＝6），97.72%-101.75%（RSD＝1.44%，n＝6），97.66%-102.34%（RSD＝1.63%，n＝6），97.33%-101.91%（RSD＝1.75%，n＝6）and 97.78%-100.74%（RSD＝1.19%，n＝6）.The RCFs of emodin to aloe emodine，rhein，chrysophanol and physcion were 1.217 7，1.153 4，1.424 2 and 1.034 5，respectively.CONCLUSIONS：The method is reliable，simple and fast，and can be used for the simultaneous determination of aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in Baoshenyi pill.

Baoshenyi pill；QAMS；Anthraquinones；HPLC

R284.1；R927

A

1001-0408（2016）36-5156-04

2016-06-01

2016-08-01）

＊副主任中藥師。研究方向：中藥制劑。電話：0518-85572867。E-mail：zhchang66@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.37