景 霞，許 靜，湛 雯，孫 芳（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，南京 210008）

呼吸通口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究Δ

景 霞＊，許 靜#，湛 雯，孫 芳（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，南京 210008）

目的：提高呼吸通口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中百部、黃芩、牛蒡子進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定制劑中黃芩苷的含量：色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（48∶52，V/V），流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為25Ⅱ，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：百部、黃芩、牛蒡子的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。黃芩苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.378 0～3.779 5 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為96.52%～104.95%（RSD＝1.28%，n＝9）。結(jié)論：提高的標(biāo)準(zhǔn)能更加有效地控制呼吸通口服液的質(zhì)量。

呼吸通口服液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；百部；黃芩；牛蒡子；薄層色譜法；黃芩苷；高效液相色譜法

呼吸通口服液（批準(zhǔn)文號(hào)：蘇藥制字Z04001263）由百部、黃芩、牛蒡子、天花粉、芫花、桔梗6味藥材共制而成。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效；百部具有潤(rùn)肺下氣、止咳之功效；牛蒡子可疏散風(fēng)熱、宣肺利咽[1-2]。諸藥共奏清熱解毒、止咳化痰之功，臨床廣泛用于上呼吸道感染、支氣管炎、低熱、咳嗽等癥的治療。原呼吸通口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（BJ-ZJ5-06）通過鹽酸鎂粉反應(yīng)和碘化鉍鉀反應(yīng)對(duì)其中的黃酮類和生物堿類成分進(jìn)行化學(xué)鑒別，不符合現(xiàn)代中藥制劑質(zhì)量控制的要求。近年有對(duì)其中成分進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)的報(bào)道[3-5]，但對(duì)其主要藥味的薄層色譜（TLC）鑒別未見報(bào)道。由此可見，本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待提高與完善。本研究中，筆者通過對(duì)呼吸通口服液的主要藥味進(jìn)行TLC鑒別，并對(duì)其中君藥黃芩有效成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，旨在更加有效地控制其質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二元泵、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；MS205DU型電子分析天平（瑞士Mettl-er-Toledo公司）；KH3200V型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：40 W，頻率：150 kHz）；TH-Ⅱ型數(shù)控薄層顯色加熱器（上海科哲生化科技有限公司）；ZF-20C型暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

呼吸通口服液（本院自制，批號(hào)：140326-1、140326-2、140326-3、140423-3、140425-3、141013-1、141013-2、141013-3，規(guī)格：10 ml/支；本院委托江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：141201，規(guī)格：10 ml/支）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201117，純度：91.7%）、對(duì)葉百部對(duì)照藥材（批號(hào)：121221-201003）、直立百部對(duì)照藥材（批號(hào)：121588-201101）、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)：120955-201309）、牛蒡子對(duì)照藥材（批號(hào)：120903-201109）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 飲片

蜜百部飲片（批號(hào)：15031401）、炒黃芩飲片（批號(hào)：15032201）、炒牛蒡子飲片（批號(hào)：14121001）、天花粉飲片（批號(hào)：14122401）、制芫花飲片（批號(hào)：14120101）、桔梗飲片（批號(hào)：14122001）均購(gòu)于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 百部的薄層鑒別 取本品20 ml，加濃氨溶液1 ml，再加乙醚20 ml振搖提取，乙醚液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另分別取直立百部和對(duì)葉百部對(duì)照藥材各0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。再按呼吸通口服液處方和制備工藝制備缺百部的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][2]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液5～10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨溶液（10∶5∶4∶0.5，V/V/V/V）為展開劑，置于氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀溶液顯色，再噴以5%亞硝酸鈉溶液（溶劑為70%乙醇）去底色，置可見光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

圖1 百部的薄層色譜圖1、2、5.供試品；3.直立百部對(duì)照藥材；4.對(duì)葉百部對(duì)照藥材；6.陰性對(duì)照Fig 1 TLC chromatograms of S.Japonica1，2，5.test samples；3.reference substance of Stemona sessilifolia；4.reference substance of Radix stemona；6.negative control

2.1.2 黃芩的薄層鑒別 取本品1 ml，加75%乙醇5 ml，搖勻，作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材0.5 g，加75%乙醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。再按呼吸通口服液處方和制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液3～5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以36%乙酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液顯色，置可見光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖2。

2.1.3 牛蒡子的薄層鑒別 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液作為本項(xiàng)試驗(yàn)供試品溶液。另取牛蒡子對(duì)照藥材，加75%乙醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。再按呼吸通口服液處方和制備工藝制備缺牛蒡子的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40∶8∶1，V/ V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105Ⅱ加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置可見光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖3。

圖2 黃芩的薄層色譜圖1～3.供試品；4.黃芩對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照品Fig 2 TLC chromatograms of S.Baicalensis1-3.test samples；4.reference substance of S.Baicalensis；5.negative control

圖3 牛蒡子的薄層色譜圖1～3.供試品；4.牛蒡子對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照Fig 3 TLC chromatograms of F.arctii1-3.test samples；4.reference substance of F.arctii；5.negative control

2.2 含量測(cè)定[3-5]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent Eclipse Plus-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（48∶52，V/V）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25Ⅱ；進(jìn)樣量：20 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以黃岑苷峰計(jì)不少于5 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖4。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度約為200 μg/ml的對(duì)照品貯備液（實(shí)際質(zhì)量濃度為188.975 4 μg/ml）。精密量取上述對(duì)照品貯備液4.0 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得。2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品1 ml，置于25 ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理2 min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按呼吸通口服液處方和制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品貯備液1、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以黃芩苷進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷回歸方程為y＝5.15×103x－1.73×102（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，黃芩苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.378 0～3.779 5 μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：140423-3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.78%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批樣品（批號(hào)：140423-3）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝1.26%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：140423-3）適量，共9份，每份5 ml，分別加入低、中、高質(zhì)量的黃芩苷對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

圖4 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品；1.黃芩苷Fig 4 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.baicalin

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 results of recovery test（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

3 討論

百部中含有多種生物堿類成分，2015年版《中國(guó)藥典》的鑒別采用了化學(xué)鑒別方法，國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)中也少有報(bào)道其TLC鑒別的方法。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[6]優(yōu)選展開系統(tǒng)進(jìn)行百部的TLC研究，用甲醇代替該展開系統(tǒng)中的丙酮，用普通的硅膠G薄層板代替高效板，所得圖譜斑點(diǎn)清晰。但由于百部分為3種基源，即對(duì)葉百部、直立百部、蔓生百部，其中的生物堿類成分差異也較大。本試驗(yàn)在采用對(duì)葉百部和直立百部為對(duì)照藥材進(jìn)行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)二者所含生物堿種類及含量均有較大差異；并且不同產(chǎn)地藥材中含有生物堿的種類和含量也不一致。因此，百部可參考金銀花與山銀花、黃柏與關(guān)黃柏分類標(biāo)準(zhǔn)，按“一物一名”的原則分類，分別建立各自的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以便更好地對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。所以在TLC鑒別中，應(yīng)根據(jù)所用藥材的基源進(jìn)行對(duì)照藥材的挑選或使用其共有成分對(duì)照品作為對(duì)照。

在9個(gè)批次制劑的含量測(cè)定中，黃芩苷的含量從2.47～4.3 mg/ml不等，相差較大，這與各省中藥材炮制規(guī)范的差異、制劑工藝過程的控制水平都存在密切的關(guān)系。本制劑工藝為水煎煮-醇沉-水沉工藝，在制劑過程中對(duì)于煎煮時(shí)間、醇沉和水沉?xí)r間均應(yīng)嚴(yán)格控制，對(duì)制劑每一個(gè)步驟的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，以期進(jìn)一步提高其有效成分的溶出率，得到較為均一的制劑質(zhì)量。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)能更加有效地控制呼吸通口服液的質(zhì)量。

[1] 張永，廖清船.HPLC同時(shí)測(cè)定呼吸通口服液中黃芩苷和牛蒡子苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（12）25.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

[3] 李洪.復(fù)方芩連清解顆粒的質(zhì)量控制[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（19）：1 681.

[4] 王亦存.HPLC法測(cè)定青果丸中黃芩苷的含量[J].中國(guó)藥房，2014，25（32）：3 057.

[5] 鄺薛洪，譚伯森.HPLC法測(cè)定黃芩清肺片中黃芩苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2014，26（6）：75.

[6] 張亞中，袁杰.蔓生百部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥物分析雜志2014，34（10）：1 856.

Study on the Quality Standard of Huxitong Oral Solution

JING Xia，XU Jing，ZHAN Wen，SUN Fang（Nanjing Children’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Huxitong oral solution.METHODS：TLC was conducted for the qualitative identification of Stemona japonica，Scutellaria baicalensis and Fructus arctii；HPLC was adopted for the content determination of baicalin：the column was Agilent Eclipse Plus-C18with mobile phase of methanol-0.1%phosphoric acid solution（48∶52，V/V）at a flow rate of 0.8 ml/min，the detection wavelength was 280 nm，column temperature was 25Ⅱ，injection volume was 20 μl. RESULTS：TLC spots of S.japonica，S.baicalensis and F.arctii were clear and well separated，with no interference in negative control.The linear range of baicalin was 0.378 0-3.779 5 μg（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recovery was 96.52%-104.95%（RSD＝1.28%，n＝9）.CONCLUSIONS：The improved standard can more effectively control the quality of Huxitong oral solution.

Huxitong oral solution；Quality standard；Stemona japonica；Scutellaria baicalensis；Fructus arctii；TLC；Baicalin；HPLC

R927

A

1001-0408（2016）36-5137-03

2016-02-16

2016-07-04

（編輯：張 靜

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目（No.2012NJMU068）

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院制劑檢驗(yàn)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：jing_xiaxia@163.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：025-83117221

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.31

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取9批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄