胡克余，汪巖峰，余衛(wèi)麟，馬 俊，鄧雙炳（深圳萬和制藥有限公司，廣東深圳 518057）

HPLC法檢測脫氫環(huán)氧甲基醌霉素中間體N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺及其雜質(zhì)Δ

胡克余＊，汪巖峰，余衛(wèi)麟，馬 俊，鄧雙炳#（深圳萬和制藥有限公司，廣東深圳 518057）

目的：建立檢測脫氫環(huán)氧甲基醌霉素（DHMEQ）中間體N-（2-乙酰氧基苯甲?；?2，5-二甲氧基苯胺（MA）及其雜質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Utimate AQ-C18，流動相為乙腈-0.05%磷酸（梯度洗脫），流速為1 ml/min，檢測波長為230 nm，柱溫為30Ⅱ，進樣量為10 μl。結(jié)果：MA與各雜質(zhì)間以及各雜質(zhì)之間的分離度均＞1.5，理論板數(shù)以MA峰計≥5 000，保留時間約為41 min；MA、乙酰水楊酸甲酯、SM2、SM1、MA-6、水楊酸、MA-2的定量限（相當(dāng)于MA樣品的百分比）分別為0.04%、0.03%、0.01%、0.05%、0.05%、0.05%、0.05%，檢測限（相當(dāng)于MA樣品的百分比）分別為0.01%、0.01%、0.004%、0.02%、0.02%、0.02%、0.02%；溶液穩(wěn)定性及方法耐用性良好。結(jié)論：該方法專屬性、檢測限、耐用性均符合要求，可用于檢測DHMEQ中間體MA及其雜質(zhì)。

脫氫環(huán)氧甲基醌霉素；中間體；N-（2-乙酰氧基苯甲?；?2，5-二甲氧基苯胺；雜質(zhì)；高效液相色譜法

脫氫環(huán)氧甲基醌霉素（Dehydroxy methyl epoxy quinomicin，DHMEQ）是由抗生素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造合成的一種新型小分子核因子-κB（NF-κB）抑制劑，具有抗癌和抗炎活性[1]。DHMEQ可特異性抑制NF-κB移位入核，以1∶1的化學(xué)計量比共價修飾p65和其他Rel同源蛋白中的特定半胱氨酸殘基[2]。DHMEQ作為NF-κB抑制劑，通過在各種疾病的動物模型中進行廣泛測試，證明其對治療實體瘤、血液惡性腫瘤、關(guān)節(jié)炎、腸缺血和動脈粥樣硬化在內(nèi)的疾病具有廣譜效力[3]，因此DHMEQ有望在臨床上用于癌癥和炎癥疾病的治療。

N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺（簡稱MA）是DHMEQ合成過程中一個重要的中間體，它的純度對終產(chǎn)品DHMEQ有顯著影響，故很有必要對其純度進行控制。結(jié)合合成工藝路線進行分析，MA中潛在的有機雜質(zhì)分別是水楊酸、阿司匹林（簡稱SM1）、2，5-二甲氧基苯胺（簡稱SM2）、乙酰水楊酰氯[高效液相色譜法（HPLC）檢測時溶劑含有甲醇，乙酰水楊酰氯以乙酰水楊酸甲酯形式存在]以及MA-2、MA-6兩個工藝雜質(zhì)。因此，本課題組采用HPLC法檢測DHMEQ中間體MA及其雜質(zhì)，旨在為該中間體的純度控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2998 PDA二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；MS105型十萬之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

MA樣品（自制，批號：20160523、20160607、20160706）；MA對照品（自制，批號：20160512105，氫譜、碳譜核定結(jié)構(gòu)，HPLC測定純度為99.6%）；乙酰水楊酸甲酯對照品（東京化成工業(yè)株式會社，批號：AG02，純度：98.9%）；水楊酸對照品（批號：100106-201104，純度：99.9%）、SM1對照品（批號：100113-201405，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；SM2對照品[阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司，批號：10183987，純度：98.6%]；MA-2對照品（自制，批號：20160104，氫譜、碳譜核定結(jié)構(gòu)，HPLC法測定純度為100%）；MA-6對照品（自制，批號：20160123，氫譜、碳譜核定結(jié)構(gòu)，HPLC法測定純度為99.0%）；乙腈為色譜純（德國Fisher公司），磷酸為色譜純（美國Tedia公司），其余試劑為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Utimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0 min，20.0%A；5 min，20.0%A；10 min，25.0%A；15 min，25.0%A；30 min，45.0%A；40 min，45.0%A；45 min，20.0%A；50 min，20.0%A）；流速：1 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30Ⅱ；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶劑 取冰乙酸10 ml，置于1 000 ml量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得空白溶劑（即1%冰乙酸甲醇溶液）。

2.2.2 混合對照品溶液 取乙酰水楊酸甲酯、水楊酸、SM1、SM2、MA-2、MA-6對照品各約10 mg，精密稱定，分別置于20 ml量瓶中，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，搖勻，制成各單一對照品貯備液；另取MA對照品10 mg，精密稱定，置于20 ml量瓶中，加入各單一對照品貯備液0.2 ml，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，搖勻，制成含MA 0.5 mg/ml和乙酰水楊酸甲酯、水楊酸、SM1、SM2、MA-2、MA-6均約為1%的混合溶對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取MA樣品約25 mg，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加1%冰乙酸甲醇溶液適量，振搖使溶解，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以MA峰計≥5 000，保留時間約為41 min。

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，分別按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），結(jié)果見表1。由表1可知，當(dāng)MA質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml時，MA及各雜質(zhì)的檢測靈敏度均符合ICH Q3A（新原料藥中的雜質(zhì)）指導(dǎo)原則關(guān)于報告限度的要求。

2.5 穩(wěn)定性與耐用性考察

2.5.1 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、10 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，MA及各雜質(zhì)峰面積的RSD均＜10%（n＝5），表明混合對照品溶液室溫下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.5.2 耐用性考察 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，分別在不同波長、流速、柱溫、流動相比例及不同批號色譜柱條件下，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，在不同波長[（230±1）nm]、不同流速[（1.0±0.1）ml/min]、不同柱溫[（30± 5）Ⅱ]、不同流動相比例（±2%）、不同批號色譜柱條件下，MA及各雜質(zhì)含量的RSD均＜10%，表明方法耐用性良好。

2.6 樣品純度測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算MA的純度。結(jié)果，3批（批號：20160523、20160607、20160706）樣品的純度分別為96.5%、97.3%、95.0%（n＝3）。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.空白溶劑；1.SM2；2.SM1；3. MA-6；4.水楊酸；5.乙酰水楊酸甲酯；6.MA-2；7.MAFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample solution；C.blank control；1. SM2；2.SM1；3.MA-6；4.salicylic acid；5.methyl acetylsalicylate；6.MA-2；7.MA

表1 定量限與檢測限測定結(jié)果Tab 1 Determination results of quantitation limit and detection limit

3 討論

MA是DHMEQ合成過程中一個重要的中間體，其純度對后續(xù)中間體和終產(chǎn)品的質(zhì)量有顯著影響，所以有必要進行其純度控制。作為中間體，MA純度測定結(jié)果是以峰面積歸一化方法計算，故不受儀器精密度、準(zhǔn)確度影響，因而未進行精密度、準(zhǔn)確度等驗證，只需按照2015年版《中國藥典》[4]限度方法學(xué)要求驗證專屬性、檢測限、耐用性足以保證本方法的可靠性。此外，MA生產(chǎn)后很快就投入下一步的反應(yīng)中，無需長期放置，故其純度測定方法的專屬性驗證重點考察分離度、溶劑干擾試驗，不進行降解試驗。

綜上所述，本方法專屬性、檢測限、耐用性均符合要求，可用于DHMEQ中間體MA及其雜質(zhì)的檢測。

[1] Matsumoto N，Ariga A，To-e S，et al.Synthesis of NF-κB activation inhibitors derived from epoxyquinomicin C [J].Bioorg.Med.Chem.Lett，2000，10（9）：865.

[2] Yamamoto M，Horie R，Takeiri M，et al.Inactivation of NF-κB Components by Covalent Binding of（-）-Dehydroxymethylepoxyquinomicin to Specific Cysteine Residues[J].J Med Chem，2008，51（18）：5 780.

[3]Horie R，Watanabe T，Umezawa K.Blocking NF-kappa-B as a potential strategy to treat adult T-cell leukemia/lymphoma[J].Drug News Perspect，2006，19（4）：201.

[4] 孫婷，楊浩天，劉紅莉，等.HPLC法測定洛伐他汀分散片中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2016，27（12）：1 683.

Determination of DHMEQ Intermediates MAand Its Impurity by HPLC Method

HU Keyu，WANG Yanfeng，YU Weilin，MA Jun，DENG Shuangbing（Shenzhen WanHe Pharmaceutical Co.Ltd，Guangdong Shenzhen 518057，China）

OBJECTIVE：To establish a HPLC method to determine DHMEQ intermediate N-（2-acetoxybenzoyl）-2，5-dimethoxyaniline（MA）.METHODS：The column was Utimate AQ-C18with mobile phase of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1 ml/min，detection wavelength was 230 nm，column temperature was 30Ⅱ，and the injection volume was 10 μl.RESULTS：The separation degrees of MA and the impurities were above 1.5，the number of theoretical plates（calculated with MA peaks）was no less than 5 000，retention time was about 41 min；the detection limits（the percentages of MA samples）of MA，methyl acetylsalicylate，SM2，SM1，MA-6，salicylic acid and MA-2 were 0.04%，0.03%，0.01%，0.05%，0.05%，0.05%and 0.05%；detection limits（the percentage of MA samples）were 0.01%，0.01%，0.004%，0.02%，0.02%，0.02%and 0.02%，respectively；the stability of solution and durability of method were good.CONCLUSIONS：The specificity，detection limit，and durability of the method are all in line with the requirements，which can be used for DHMEQ intermediate MA and its impurity.

DHMEQ；Intermediate；N-（2-acetoxybenzoyl）-2，5-dimethoxyaniline；Impurity；HPLC

R927

A

1001-0408（2016）36-5125-03

2016-09-21

2016-11-07）

（編輯：劉 柳）

國家科技重大專項——重大新藥創(chuàng)制項目（No.2012ZX09103101-004）；廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)項目（No.2012A080800010）；深圳市技術(shù)研究開發(fā)計劃（三大產(chǎn)業(yè)）項目（No.JSA201105090126A）

＊工程師。研究方向：藥品質(zhì)量、項目管理及注冊申報。E-mail：hukeyu@wanhe-phar.com

#通信作者：工程師，碩士。研究方向：藥品質(zhì)量、項目管理及注冊申報。E-mail：dengshuangbing@wanhe-phar.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.26