金鑫，吳波，畢曉云，陳晶礪，盧懷筍，鐘轉(zhuǎn)弟，溫麗娟

（1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510730；2.廣東省江門中醫(yī)藥學(xué)校，廣東 江門 529000）

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞釋放膜微囊相對(duì)理想條件的體外實(shí)驗(yàn)研究

金鑫1，吳波2，畢曉云1，陳晶礪1，盧懷筍2，鐘轉(zhuǎn)弟1，溫麗娟1

（1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510730；2.廣東省江門中醫(yī)藥學(xué)校，廣東 江門 529000）

目的 通過體外實(shí)驗(yàn)考察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞釋放膜微囊的相對(duì)理想條件。方法將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)5代后，再以血清和低氧為交互培養(yǎng)條件，分別進(jìn)行有血清-常氧(Norm)、無血清-常氧(SF)、有血清-低氧（Hypo）及無血清-低氧(Hypo-SF)四種不同條件下的72 h培養(yǎng)，最后收集膜微囊進(jìn)行觀察鑒定，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)分析膜微囊表面分子表達(dá)及蛋白定量。結(jié)果透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)條件下的樣本照相均有觀察到膜狀結(jié)構(gòu)，且其中心呈低密度區(qū)，多數(shù)膜結(jié)構(gòu)直徑不超過100 nm，部分發(fā)生聚集，整體形態(tài)學(xué)特征符合膜微囊特點(diǎn)；流式細(xì)胞術(shù)分析膜微囊的表面標(biāo)記與來源細(xì)胞人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相似，二者均表達(dá)CD29、CD44、CD73及CD105，對(duì)CD31及CD45不表達(dá)，提示該膜微囊為來源于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；收獲細(xì)胞數(shù)分別為Norm培養(yǎng)：(1.63±0.28)×108個(gè)，SF培養(yǎng)：(0.72±0.25)×108個(gè)，Hypo培養(yǎng)：(2.32±0.34)×108個(gè)，Hypo-SF培養(yǎng)：(1.48±0.33)×108個(gè)，Hypo培養(yǎng)顯著高于Norm、SF、Hypo-SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.367、6.925、4.216，P＜0.05)，Hypo-SF顯著高于SF培養(yǎng)(t=2.917，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Norm培養(yǎng)與Hypo-SF培養(yǎng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.827，P＞0.05)。膜微囊蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，相同細(xì)胞數(shù)量所產(chǎn)生的膜微囊蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)。結(jié)論低氧是促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞釋放膜微囊相對(duì)更為理想的條件之一，同時(shí)建議采用低氧條件下的無血清培養(yǎng)。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；膜微囊；釋放；條件；體外實(shí)驗(yàn)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stromal cell，MSC)為一類成體干細(xì)胞總稱，此類細(xì)胞不僅具有較強(qiáng)的體外增殖能力及調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞功能的作用，還具備成脂細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的功能[1]。目前MSC已獲得初步應(yīng)用，且進(jìn)展順利[2-3]。同時(shí)大量研究業(yè)已證實(shí)[4-6]，MSC還具有頗強(qiáng)的促血管再生作用，這進(jìn)一步為心肌梗死與外周血管病的臨床治療指出了新的方向。稍早期的一些研究指出，MSC促血管再生的主要機(jī)制是基于其所具有的旁分泌作用[7]，但新近的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由MSC所釋放的膜微囊(Microvesicles，MV)在體外可顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，故推測其可對(duì)機(jī)體內(nèi)已發(fā)生損傷的血管具修復(fù)作用[8]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stromal cell，hUC-MSC)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，其兼具有易于大量獲取、免疫原性低以及可在不加用免疫抑制劑的情況下長期存活等諸多優(yōu)勢，較其他種類MSC更具臨床開發(fā)前景[9]。本研究對(duì)hUC-MSC釋放MV的相對(duì)理想條件進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)探索，旨在為后續(xù)臨床應(yīng)用hUC-MSC-MV開展外周血管病等疾病的治療提供理論基礎(chǔ)，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集 本研究臍帶標(biāo)本均取自健康足月順產(chǎn)的新生兒，共5份，由筆者所在醫(yī)院產(chǎn)科提供。產(chǎn)婦及其家屬對(duì)本研究均知情同意，符合醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的人標(biāo)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用規(guī)范。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備及試劑 人臍帶MSC培養(yǎng)用胎牛血清(購自Stemcell公司)；alpha-MEM培養(yǎng)液(購自維森特生物技術(shù)有限公司)；磷酸緩沖液PBS(自制)；2-嗎啉乙磺酸生物緩沖液MES(自制)；透射電子顯微鏡(H-7650型，購自日立公司)；Optima L-100XP型超速離心機(jī)(Beckman Coulter公司)；乙酰化乳膠珠(Invitrogen公司)；PE標(biāo)記的小鼠抗人CD29、CD31、CD44、CD45、CD73及CD105單克隆抗體(SEROTEC公司)。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶MSC的培養(yǎng)及鑒定 參考徐燕等[10]文獻(xiàn)資料進(jìn)行人臍帶MSC培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中對(duì)全部標(biāo)本細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、表明標(biāo)記檢測及分化能力鑒定，所獲細(xì)胞均符合人MSC特征[11]。將細(xì)胞培養(yǎng)5代后再開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞預(yù)處理 先將MSC懸浮于Alpha-MEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液分含或不含10%胎牛血清兩種，接著分別接種到150 mm的培養(yǎng)皿中，每皿含細(xì)胞2×106個(gè)，以血清和低氧(1.0%)為交互培養(yǎng)條件，將接種后的培養(yǎng)皿各20份樣本分別放置到有血清-常氧(Norm)、有血清-低氧(Hypo)、無血清-常氧(SF)及無血清-低氧(Hypo-SF)四種不同條件下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

1.2.3 收集MV并觀察鑒定 采用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，活細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)。收集培養(yǎng)上清液離心處理，2 000×g離心10 min將細(xì)胞碎片去除，接著以0.45 μm濾膜過濾。再將上清液以100 000×g離心處理2 h，并采用PBS將獲得的沉淀物(MV)洗滌2 h，再接著向其加入緩沖液(含KCl為5 mmol/L，MgCl2為1 mmol/L，NaCl為136 mmol/L)，混勻后以每管50 μL分裝至Ultra-Clear離心管中，放置到-80℃冰箱中并采用透射電子顯微鏡對(duì)hUC-MSC-MV的形態(tài)特征進(jìn)行逐一觀察鑒定，同時(shí)放大10 000倍照相。

1.2.4 hUC-MSC-MV的表面分子表達(dá)及蛋白定量分析 參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行表型標(biāo)記分析。將MV懸液加入到懸浮有直徑3.9 μm乙?；槟z珠的MES緩沖液中，在4℃環(huán)境中反應(yīng)并過夜，次日將乳膠珠洗滌去除，分別加入各單克隆抗體后室溫下避光反應(yīng)20 min。再次PBS洗滌，流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)，采用WinMdi 2.9軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，以代表單個(gè)及兩個(gè)珠子聚合的點(diǎn)數(shù)據(jù)設(shè)門，分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Bradford法測定蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MV的形態(tài)學(xué)特征及鑒定 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)條件下的樣本照相均有觀察到膜狀結(jié)構(gòu)，且其中心呈低密度區(qū)，多數(shù)膜結(jié)構(gòu)直徑不超過100 nm，部分發(fā)生聚集，整體形態(tài)學(xué)特征符合膜微囊特點(diǎn)[13]，見圖1。

圖1 10 000倍hUC-MSC-MV電子顯微鏡下的形態(tài)特征

2.2 MV攜帶MSC表型標(biāo)記分析結(jié)果 MV的表面標(biāo)記與來源細(xì)胞hUC-MSC相似，二者均表達(dá)CD29、CD44、CD73及CD105，對(duì)CD31及CD45不表達(dá)，見圖2。說明該MV為來源于hUC-MSC，為hUC-MSC-MV。

2.3 不同培養(yǎng)條件下的hUC-MSC細(xì)胞計(jì)數(shù)及MV蛋白總量比較 結(jié)果顯示，收獲細(xì)胞數(shù)分別為Norm培養(yǎng)：(1.63±0.28)×108個(gè)，SF培養(yǎng)：(0.72±0.25)× 108個(gè)，Hypo培養(yǎng)：(2.32±0.34)×108個(gè)，Hypo-SF培養(yǎng)：(1.48±0.33)×108個(gè)，Hypo培養(yǎng)顯著高于Norm、SF、Hypo-SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.367，6.925，4.216，P＜0.05)，Hypo-SF顯著高于SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.917，P＜0.05)，Norm培養(yǎng)與Hypo-SF培養(yǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.827，P＞0.05)；MV蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)；將收獲細(xì)胞數(shù)與MV蛋白總量相結(jié)合進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，相同細(xì)胞數(shù)量所產(chǎn)生的MV蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)(圖3)。

圖2 MV攜帶MSC表型標(biāo)記分析

圖3 hUC-MSC收獲的細(xì)胞數(shù)

3 討 論

MV為一種膜狀結(jié)構(gòu)。由多種細(xì)胞在激活、增殖甚至靜息狀態(tài)下釋放，可作為細(xì)胞間相互作用的重要介質(zhì)[14-16]。研究認(rèn)為，MSC具有促血管再生功能，而該功能并非源于細(xì)胞的直接分化作用，而應(yīng)主要?dú)w功于其所產(chǎn)生的MV[17]。然而，目前對(duì)通過體外培養(yǎng)MSC來產(chǎn)生MV的實(shí)驗(yàn)條件尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MV蛋白總量從高到低依次為Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，其中Hypo培養(yǎng)、Hypo-SF培養(yǎng)的MV蛋白總量高于SF培養(yǎng)和Norm培養(yǎng)，該結(jié)果提示低氧可促進(jìn)MSC釋放MV。但低氧促進(jìn)MSC釋放MV的機(jī)制，至今尚未闡明。但從已開展的相關(guān)研究中可窺見一二。如有研究顯示，低氧對(duì)骨髓及臍帶MSC的增殖具有促進(jìn)作用[18]，細(xì)胞在增殖或被激活過程中會(huì)釋放MV，低氧條件下，細(xì)胞較強(qiáng)的增殖能力也可致使MSC釋放MV。本研究結(jié)果顯示，Norm培養(yǎng)(1.63±0.28)×108個(gè)，SF培養(yǎng)(0.72±0.25)× 108個(gè)，Hypo培養(yǎng)(2.32±0.34)×108個(gè)，Hypo-SF培養(yǎng)(1.48±0.33)×108個(gè)，Hypo和Hypo-SF培養(yǎng)數(shù)顯著高Norm、SF培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)研究相符。證實(shí)了低氧有助于骨髓及臍帶MSC的增殖。

臍帶MSC在低氧刺激48 h后即可在mRNA水平高表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)[19]。刺激持續(xù)72 h，MSC高表達(dá)HIF蛋白分子以及與能量代謝相關(guān)的分子，如乳酸脫氫酶和葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-1等。HIF是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及促紅細(xì)胞生成素(EPO)的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們是低氧刺激下細(xì)胞主要的反應(yīng)因子，與血管新生密切相關(guān)[20]。此外，我們?cè)谘芯恐羞M(jìn)一步將收獲細(xì)胞數(shù)與MV蛋白總量相結(jié)合進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，相同細(xì)胞數(shù)量所產(chǎn)生的MV蛋白總量從高到低依次為Hypo-SF培養(yǎng)、Hypo培養(yǎng)、SF培養(yǎng)及Norm培養(yǎng)，Hypo-SF培養(yǎng)與其他三種培養(yǎng)比較以及Hypo培養(yǎng)與后兩者比較均有顯著性差異，提示無血清培養(yǎng)也可增加MSC釋放MV的量。其具體機(jī)制目前未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。但我們可以肯定的是，在加用血清進(jìn)行培養(yǎng)后，為確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性，我們還必須將血清離心清除，而這個(gè)過程也難免不會(huì)對(duì)MV造成干擾。同時(shí)血清本身還可能存在有病毒活性及其他未知微生物，不僅可混雜于MV中而影響相關(guān)檢測，而且也在一定程度上增加了研究者及臨床試驗(yàn)者的感染風(fēng)險(xiǎn)。故總體來看，完全沒必要將血清納入hUC-MSC體外培養(yǎng)釋放MV的培養(yǎng)基質(zhì)材料，甚至不用的益處更多。

總之，本次體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，低氧是促進(jìn)hUC-MSC釋放MV相對(duì)更為理想的條件之一，這可為臨床應(yīng)用hUC-MSC-MV開展外周血管病等疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。然而，低氧促進(jìn)hUC-MSC釋放MV的具體機(jī)制，改變條件所生產(chǎn)的MV所攜帶的活性物質(zhì)是否也同時(shí)具有某些質(zhì)的差異，仍有待進(jìn)一步探索闡明。

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In vitro study of the relatively ideal conditions for the release of microvesicles in human umbilical cord mesenchymal stromal cell.

JIN Xin1,WU Bo2,BI Xiao-yun1,CHEN Jing-li1,LU Huai-sun2,ZHONG Zhuan-di1,WEN Li-juan1.1.Department of Clinical Laboratory,the Development District People's Hospital of Guangzhou,Guangzhou 510730, Guangdong,CHINA;2.The School of Traditional Chinese Medicine of Jiangmen City,Jiangmen 529000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the relatively ideal conditions for the release of microvesicles(MV)in human umbilical cord mesenchymal stromal cell(hUC-MSC)through in vitro experiments.MethodsAfter cultivation for 5 generations,the hUC-MSCs were cultured for 72 h,with serum and hypoxia as culture conditions for interaction,under four different conditions:serum and normoxia(Norm),serum-free and normoxia(SF),serum and hypoxia(Hypo), serum-free and hypoxia(Hypo-SF).MV were collected for identification and observation,and molecule expression and protein quantitation on MV surface were determined by flow cytometric analysis.ResultsTransmission electron microscopy(TEM)observation showed that membrane structure was observed in the sample under different culture conditions.The structure showed low density in the center and had a diameter of less than 100 nm mostly,with partial aggregation,whose overall morphology was found in accordance with the characteristics of MV.Flow cytometric analysis revealed that surface markers of the membrane were similar with the source hUC-MSC,which both expressed CD29, CD44,CD105,CD73,and did not express CD31 and CD45,indicating that the membrane was derived from hUC-MSC. The number of harvested cells was(1.63±0.28)×108for Norm culture,(0.72±0.25)×108for SF culture,(2.32±0.34)×108for Hypo culture,and(1.48±0.33)×108for Hypo-SF culture,which was significantly higher in Hypo culture than Norm, SF,Hypo-SF culture(t=3.367,6.925,3.367,P＜0.05),as well as in Hypo-SF culture than SF culture(t=2.917,P＜0.05), with no significant difference between Norm culture and Hypo-SF culture(t=0.827,P＞0.05).The total amount of MV protein from high to low was in the order of Hypo culture,Hypo-SF culture,SF culture,and Norm culture,and the MV protein produced by the same amount of cells from high to low was in the order of Hypo-SF culture,Hypo culture,SF culture,Norm culture.ConclusionHypoxia is one of the relatively desirable conditions to promote the release of MV in hUC-MSC,and the use of serum-free culture under hypoxic conditions is recommended.

Human umbilical cord mesenchymal stromal cell(hUC-MSC);Microvesicles(MV);Release;Conditions;In vitro

R329.2+7

A

1003—6350（2016）12—1896—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.002

2016-02-28)

廣東省江門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20150020003139）

金鑫。E-mail：657237479@qq.com