王　杰,陳穎鈺,彭清潔,郭愛珍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢 430070)

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沙門菌檢測方法研究進(jìn)展

王杰,陳穎鈺*,彭清潔,郭愛珍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢 430070)

摘要：沙門菌不僅是一種重要的畜禽病原菌，而且還是一種主要的食源性致病菌，對畜牧生產(chǎn)和公共衛(wèi)生都具有巨大的威脅。因此，加強(qiáng)對沙門菌的快速準(zhǔn)確檢測是保障畜禽生產(chǎn)安全和食品安全的一種必需且有效的手段。目前沙門菌的檢測方法包括傳統(tǒng)細(xì)菌分離和生化鑒定、分子鑒定和免疫學(xué)檢測等方法，其中，傳統(tǒng)細(xì)菌分離并做生化鑒定的方法雖被認(rèn)定為沙門菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但較為耗時；分子鑒定通過檢測特異性目標(biāo)片段的有無，在遺傳物質(zhì)水平上鑒定致病菌種屬；免疫學(xué)檢測法則對樣品中抗原或者抗體進(jìn)行檢測。依據(jù)各方法的特點，在不同的實際運用過程中需要選擇相應(yīng)的檢測方法，以便實現(xiàn)快速診斷、及時治療和處置相關(guān)疾病與食品安全事件的目標(biāo)。

關(guān)鍵詞：沙門菌；檢測方法；細(xì)菌分離；生化鑒定；分子鑒定；免疫學(xué)檢測

引起沙門菌病的病原體屬于腸桿菌科沙門菌屬，主要寄生在動物腸道，可以通過侵襲腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)宿主全身感染，出現(xiàn)敗血癥和菌血癥，并可通過分泌細(xì)胞毒素或者引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致機(jī)體呈現(xiàn)出腹瀉、發(fā)熱等癥狀[1]。

不同血清型沙門菌對不同宿主具有不同的感染力。在所有家畜中，仔畜是對沙門菌極為敏感的動物群體。能引起牛感染的沙門菌主要包括鼠傷寒沙門菌及都柏林沙門菌；引起豬感染的沙門菌主要是豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌和鼠傷寒沙門菌；雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌是引起禽沙門菌病的主要血清型。

多種對動物致病的沙門菌是主要的食源性致病菌。在英國，由食源性疾病引起的死亡中，沙門菌占到了28%[2]；在西班牙的加泰羅尼亞自治區(qū)的醫(yī)院里，有78%的急性胃腸炎病例是由沙門菌引起的[3]；在美國每年約有140萬例沙門菌感染病例[4],并引起400多人死亡[5]。我國細(xì)菌性食物中毒中70%～80%歸因于沙門菌, 且多因食用污染的肉、蛋、奶等動物源性食品而發(fā)病[6]。

因此，加強(qiáng)對動物機(jī)體內(nèi)沙門菌的檢測是保障畜禽健康和動物性食品安全的重要環(huán)節(jié)。

1沙門菌細(xì)菌學(xué)特征

沙門菌屬是一群能寄生在人和動物腸道內(nèi)的革蘭陰性菌，兼性厭氧。絕大多數(shù)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，偶爾有不產(chǎn)氣的，常產(chǎn)生H2S。

按照最新的分類方案，根據(jù)遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)DNA同源性，本屬菌可分為腸道沙門菌和邦戈爾沙門菌2種，共7個亞種；在血清型鑒定方面，沙門菌具有O、H、K和菌毛4種抗原，至少2 500個血清型，其中O抗原是每個菌株必有的成分。

本屬菌具有極其廣泛的動物宿主，是一種重要的人畜共患病病原。能引起人的傷寒、副傷寒、急性腸胃炎、敗血癥等疾病。還可以侵害幼齡動物發(fā)生敗血癥，對成年動物常常引起散發(fā)性疾病，可導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)。

根據(jù)對宿主的嗜性不同，又可將沙門菌分為3群：第1群是具有專嗜性，只對某些動物產(chǎn)生特定的疾病，例如雞白痢、雞傷寒、馬流產(chǎn)、羊流產(chǎn)沙門菌等；第2群是在一定程度應(yīng)用于特定動物的偏嗜性沙門菌，如都柏林沙門菌是牛和羊的強(qiáng)適應(yīng)性菌株，但也能感染其他動物；第3群是泛嗜性沙門菌，具有廣泛的宿主，其中的代表包括鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。

2傳統(tǒng)分菌方法

大多數(shù)的細(xì)菌鑒定方法其前提是分離出純的細(xì)菌培養(yǎng)物。針對臨床上肉、牛奶、糞便或者環(huán)境樣本等多種樣本類型，沙門菌分離方法也存在有差異：在國際上，歐洲大都采用國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(international organization for standardization，ISO)的標(biāo)準(zhǔn)[7]；其中ISO標(biāo)準(zhǔn)針對糞便里的沙門菌的檢測增加了一個附件說明[8]；美國有自己的細(xì)菌學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)；我國主要依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2010進(jìn)行沙門菌的分離與鑒定。

傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法一般都包含如下四個步驟:

第一步：預(yù)增菌。傳統(tǒng)檢測技術(shù)前期都需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理，使菌群溶解在液體中以方便操作。

無論是食品還是糞便，或經(jīng)過加工使菌體受到損傷或由于目標(biāo)菌種含量低，均需要進(jìn)行復(fù)蘇和增菌。針對不同的樣品，不同檢測標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)處理方式也存在差異：緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)的作用在于能非選擇性修復(fù)物理或化學(xué)傷害的細(xì)菌，適合處理食品樣本；乳糖肉湯的缺點在于大部分腸桿菌均能在其中生長。

第二步，選擇性增菌。不同的增菌液在促進(jìn)沙門菌的生長方面均有不同的偏向性。改良半固體氯化鎂孔雀綠增菌液有利于運動型沙門菌的檢測[8]。亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth,SC)在不影響其他腸道菌生長的情況下促進(jìn)沙門菌的生長，四硫磺酸鈉亮綠增菌液(tetrathionate broth base,TTB)是抑制除沙門菌外其他腸道菌群的生長。由于一種增菌液不可能適合所有的沙門菌生長，因此，對沙門菌進(jìn)行選擇性增菌要同時用兩種增菌培養(yǎng)液。

第三步，選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。乳糖生化試驗陽性的沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽鹽(xylose lysine desoxycholate agar,XLD)培養(yǎng)基上顯示為非典型菌落,亮綠瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂作為補(bǔ)充性的選擇性培養(yǎng)基，特別是適合于分離乳糖陽性的沙門菌、傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌的培養(yǎng)；有些沙門菌例如雞白痢、雞傷寒沙門菌生長緩慢，在XLT4 (xylose lysine tergitol TM 4 agar)上生長更好，菌落大小適中[9]，當(dāng)然，由于雞白痢和雞傷寒沙門菌具有宿主適應(yīng)性，所以在牛源沙門菌檢測中可以認(rèn)為XLD和XLT4無明顯差異；在實際運用中表明添加無色的特異性酶作為底物的顯色培養(yǎng)基，能大大減少挑選可疑菌落的數(shù)量。

第四步，純化菌落。一般挑取可疑典型菌落在麥康凱培養(yǎng)基上劃線，以獲取單個純菌落。

傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法通常需要3 d～5 d才能完成，耗費時間長，且非運動型沙門菌在環(huán)境樣本中存活時間不長，因此對樣本就需要及時處理；XLD和SS(salmonella-shigella agar)沙門菌-志賀菌瓊脂培養(yǎng)基同時能用于志賀菌的分離，造成假陽性；在實際操作中，同一菌株在培養(yǎng)基上可能因為生長位置不同營養(yǎng)供給有差異，形成典型或者非典型菌落；同時由于對菌落的識別和挑取大多只限于經(jīng)驗的積累，因此傳統(tǒng)方法的敏感度不高，主觀性強(qiáng)；另外在不同部位分離出的沙門菌其生化結(jié)果并不是絕對一樣的[7],增加了判定的復(fù)雜程度。

盧勉飛等[10]發(fā)現(xiàn),國內(nèi)外不同廠家4種沙門菌分離培養(yǎng)基在特異性和選擇性方面基本一致，生長率差異不顯著；Love B C等[11]比較了5種不同配伍的沙門菌分離方法，結(jié)果顯示不同配伍方法間,效果差異顯著且單一方法的檢出率低；Cummings K J等僅用TTB一種增菌液發(fā)現(xiàn)紐約55個奶牛場環(huán)境中沙門菌攜帶率為22%[12]。所以很多標(biāo)準(zhǔn)建議,在第二步和第三步分別至少使用2種以上培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

3生化鑒定方法

參照沙門菌屬生化反應(yīng)鑒別標(biāo)準(zhǔn)將純化后的菌落進(jìn)行生化試驗，進(jìn)一步確定其是否為沙門菌。將確定的沙門菌再做血清型檢測以確定其血清型。

Seran等發(fā)現(xiàn)在單份樣本中會存在多種血清型沙門菌，且這種存在幾率并非偶然[13]，從而提醒在上述第四步純化菌落時，應(yīng)注意選取多個可疑菌落進(jìn)行純化，然后分別做生化試驗和血清學(xué)試驗，以免丟失單個樣本中的多個血清型；生化鑒定過程繁瑣、鑒定管顏色變化的判定存在主觀因素，是此種鑒別方法的最顯著缺點。傳統(tǒng)方法雖然是各國公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其時間的滯后性，難以滿足快速檢測的要求，因此有必要發(fā)展更為準(zhǔn)確、快捷的沙門菌檢驗方法。

4分子鑒定方法

以核酸檢測為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定方法能夠通過檢測特異性目標(biāo)片段的有無，在遺傳物質(zhì)水平上鑒定致病菌種屬。

此類方法通過一定的技術(shù)在體外對目標(biāo)基因DNA 片段進(jìn)行快速擴(kuò)增，使其達(dá)到檢測手段所需要的檢查量，然后再由后續(xù)的檢測方法做出最終判定[14]。目標(biāo)基因一般是選擇細(xì)菌的管家基因中的一段或幾段特異性序列或者含特異性酶切位點片段用以在遺傳物質(zhì)水平上檢測區(qū)分。而血清學(xué)分型是在其蛋白表達(dá)表型方面對其同種異性進(jìn)行區(qū)分。

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是現(xiàn)在最普遍使用的DNA擴(kuò)增技術(shù)，在生物信息學(xué)研究基礎(chǔ)上發(fā)展的PCR技術(shù)不僅能區(qū)分生化群，還能通過對多條目的基因的篩選來鑒定其血清型。從Rahn開始運用此方法到現(xiàn)在，用于沙門菌檢測的PCR方法引物設(shè)計多基于invA、stn、16 S rDNA、phoP等保守基因。這些序列大部分為沙門菌特有的毒力相關(guān)基因，存在于染色體或毒力質(zhì)粒上[15]。Ziemer C J等[16]在試驗中，發(fā)現(xiàn)以沙門菌stn、16 S rDNA、組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子(histidine transport operon)3種保守基因設(shè)計的引物，對多種非沙門腸道菌的陰性率為100%。Yan L等[17]運用沙門菌相關(guān)引物檢測沙門菌的靈敏度能到達(dá)到1 CFU/ 25 g，具有很高的靈敏度，但是Jensen A N等[18]認(rèn)為real-time PCR在檢測亞臨床感染樣品時的靈敏度和傳統(tǒng)細(xì)菌檢測學(xué)方法無差異。

隨著PCR的快速高效的優(yōu)點逐漸為人們所知，PCR技術(shù)不僅在更廣泛的領(lǐng)域中得到運用，研究人員還不斷對其進(jìn)行了完善。

重復(fù)基因外回文序列PCR(Rep-PCR)是一種通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)回文序列，然后根據(jù)電泳條帶的大小和帶型來區(qū)分細(xì)菌種類的改良型PCR方法；實時熒光定量PCR解決了普通PCR不能定量檢測致病菌數(shù)量的難題，同時因為在核酸擴(kuò)增的過程中就能看到檢測結(jié)果，明顯的縮短了檢測時間，石曉路[19]指出，在此方法中應(yīng)注意增菌液對熒光PCR反應(yīng)的影響；反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)由于對細(xì)菌的數(shù)量和活力有要求，在檢測前需要增菌培養(yǎng)，由于RT-PCR能指示活菌的存在，所以在檢疫方面具有實際意義[20]；由于PCR體系中可能存在多種因素影響片段的成功擴(kuò)增，單一特異性目標(biāo)片段技術(shù)的假陰性較高，因此擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的添加是必不可少的。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是21世紀(jì)以后開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，相比較普通PCR而言，它在省去了高溫變性過程同時也實現(xiàn)了肉眼觀察結(jié)果的技術(shù)，節(jié)省時間的同時降低了使用同位素的污染，還可實現(xiàn)高通量檢測[14]。Fan F等[21]構(gòu)建了一種檢測組織沙門菌的LAMP方法，在細(xì)菌低拷貝數(shù)的前提下，其靈敏度比RT-PCR高10倍，同時還縮短了3 h 的檢測時間，大大提高了檢測的靈敏度。但同時LAMP技術(shù)也存在引物設(shè)計要求較高、較高的假陰性率和對目標(biāo)靶序列長度要求短等缺點。

隨著第三代基因組測序技術(shù)單分子實時DNA測序的發(fā)展，進(jìn)一步促進(jìn)了基因組測序向快速、高效,長片段檢測方向的發(fā)展。未來基因組測序技術(shù)若能廣泛應(yīng)用并且將鑒定范圍精確到種，將會大大提高實驗室病原體的檢測效率。

需要指出的是分子鑒定方法由于其大部分設(shè)備造價昂貴,而單個樣品檢測費用相對設(shè)備價格十分便宜，適合綜合診斷室研究使用，同時此種方法適合在價值較高的動物身上使用，不利于在養(yǎng)殖場推廣。

5免疫學(xué)檢測法

免疫學(xué)檢測法包括乳膠凝集技術(shù)、膠體金試紙條檢測技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、斑點免疫層析法、免疫磁珠分離技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)等。在養(yǎng)殖場常常利用試紙條進(jìn)行檢測，其他技術(shù)常見于在實驗室運用。此類方法原理是對樣品中的特異性抗原或抗體進(jìn)行檢測。由于抗原抗體能在短時間內(nèi)完成結(jié)合反應(yīng)，技術(shù)可實現(xiàn)自動化，勞動強(qiáng)度比傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法降低很多，因此適合在大規(guī)模監(jiān)測項目中應(yīng)用。

由于我國國民肉類消費以豬肉為主，針對豬源沙門菌的檢測，相應(yīng)的商業(yè)化檢測試紙條和ELISA試劑盒產(chǎn)品已經(jīng)十分成熟；在瑞典和丹麥已經(jīng)實現(xiàn)對牛源都柏林和鼠傷寒2種沙門菌血清型ELISA抗體檢測試劑盒的商業(yè)化生產(chǎn)。

免疫學(xué)檢測方法相比較前兩種方法的優(yōu)點在于不需要對細(xì)菌進(jìn)行純化。膠體金試紙條使用方便、其結(jié)果分析快、肉眼可見，但靈敏度一般。Preechakasedkit P等[22]發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條檢測靈敏度為105CFU/mL。ELISA技術(shù)相對于試紙條檢測所需時間長，對人員素質(zhì)和設(shè)備要求較高，近年來,此方法的改進(jìn)主要集中在單抗和多抗的開發(fā)[23]，以及新型聚合物膜材料的開發(fā)以提高其靈敏度。Jain S等[24]開發(fā)的改良聚碳酸酯膜應(yīng)用多克隆O型抗體在檢測沒有經(jīng)前增菌處理的傷寒沙門菌時的靈敏度能達(dá)到2×103CFU/mL；免疫磁珠是指具有超順磁性、表面能被-OH、 -NH2、-COOH等基團(tuán)或者抗體修飾、形成具有很好的生物親和性的粒子, 需要指出的是，免疫磁珠分離技術(shù)能有效捕獲食品加工過程中“致傷”的病原菌，進(jìn)而在一定程度上能有效節(jié)省前增菌所花費的培養(yǎng)時間，同時能將沙門菌檢測靈敏度提高到103CFU/mL[25]。

隨著人們對疾病檢測方便性的需要，更多的欄圈旁檢測(point of care testing，POC)可移動式裝置被創(chuàng)造出來。微流體技術(shù)就是其中典型代表之一，它是將樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測等步驟集成到生物芯片上，在數(shù)十微米級寬的通道上分析處理小批量液體的一種技術(shù)，有樣品需求用量小、敏感性強(qiáng)、分析快速等優(yōu)點[26]。與傳統(tǒng)ELISA方法相比，POC在某些方面可以替代甚至彌補(bǔ)其不足，如緊急救護(hù)，貧困地區(qū)，無合格實驗室地區(qū)。研究者憑借其為載體，結(jié)合現(xiàn)有方法，不僅提升了檢測的質(zhì)量，還促進(jìn)了檢測的方便性[27]。在臺灣，POC檢測最終為人們廣泛接受花費了近30年的時間，而在國內(nèi)卻剛剛起步。雖然這種技術(shù)還處于早期階段，仍然有許多需要改進(jìn)的地方，但因其不受檢測場所和運輸條件的限制，很可能是未來技術(shù)發(fā)展的一種趨勢。

6小結(jié)

綜上所述，雖然沙門菌檢測方法多種多樣，但是由于各自技術(shù)特點，在不同的實際運用情況下需要選擇相應(yīng)的檢測方法以達(dá)到經(jīng)濟(jì)或者科研目的。

傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法應(yīng)用于活菌株的收集，但其靈敏度低；生化試驗是公認(rèn)的確定細(xì)菌種屬的方法；PCR方法靈敏度高，三者結(jié)合有利于在實驗室條件下對臨床和亞臨床沙門菌病的調(diào)查、診斷和健康牛群篩選，此方法還適用于組織中低濃度細(xì)菌的檢測。同時，應(yīng)用細(xì)菌噬菌體分型方法，有利于疾病暴發(fā)時的診斷[28]。

免疫學(xué)檢測方法由于其靈敏度低的缺點適合針對發(fā)病群體進(jìn)行檢測，膠體金試紙條和ELISA試劑盒操作方便，結(jié)果易于讀取，適合在養(yǎng)殖場中推廣使用和大批次的調(diào)查。

隨著微流體技術(shù)的發(fā)展，若其能夠?qū)崿F(xiàn)成熟化，未來將有利于促使診斷操作從實驗室中解放出來，從而在沙門菌凈化過程中發(fā)揮巨大作用。

還有很多其他方法在未來都有很好的前景，但是對病原菌的有效檢測仍是未來臨床傳染病檢測技術(shù)共同的發(fā)展目標(biāo)。實踐證明，加強(qiáng)管理，采取有效隔離措施，能減少沙門菌病的發(fā)生[29]。參考文獻(xiàn):

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Progress on Detection Methods ofSalmonella

WANG Jie,CHEN Ying-yu,PENG Qing-jie,GUO Ai-zhen

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Abstract:Salmonella is not only an important pathogen of livestock,but also a significant food-borne pathogen and is a great threaten to the production of animals and public health.To detect Salmonella quickly and accurately is effective and necessary for the animal production safety and food safety.Traditional bacterium isolation and biochemical identification,molecular identification and immunological detection are the main methods for Salmonella detection now.Among which, traditional bacterium isolation and biochemical identification are regarded as the "gold standard",but take time;molecular method is available for identification of the pathogen species in genetic level by test the target fragment;immunological method is to detect the antigens and antibodies.Based on the different features,we should choose different method for detection according to the situation to realize the goals of rapid diagnosis of treatment and disposing related diseases and food safety incidents.

Key words:Salmonella;detection;bacteral isolation;biochemistry identification;molecular identification;immunological detection

文章編號:1007-5038(2016)04-0094-05

中圖分類號:S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：王杰(1991-)，男，河南武陟人，碩士研究生，主要從事動物流行病學(xué)調(diào)查。*通訊作者

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403054)

收稿日期：2015-09-04