李微，張娜

女性生育力保存技術的研究進展

李微，張娜△

近年女性生育力保存的問題引起人們的密切關注，其適用人群包括卵巢功能不全患者、腫瘤患者、自身免疫性疾病患者、欲將生育年齡延后的人群等。由于放化療藥物的使用造成女性生育力下降，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，因此年輕的腫瘤患者可能成為生育力保存的主要目標人群。生育力保存的方式包括3種：胚胎冷凍、卵母細胞冷凍及卵巢組織冷凍。胚胎冷凍技術已經(jīng)成功應用于臨床，卵母細胞冷凍技術亦日趨成熟，但卵巢組織冷凍技術尚處于研究初始階段，應用前景廣泛。3種生育力保存方式均可采用慢速冷凍方法和玻璃化冷凍方法進行冷凍保存，2種方法各有優(yōu)缺點。綜述近年來對生育力保存的范圍、方法及今后需要解決的問題，為進一步研究提供思路。

女（雌）性；生育力；低溫保存；卵母細胞；腫瘤

【Abstract】The fertility preservation is suitable for those patientswith primary ovarian insufficiency，tumor，autoimmune disease，and those people who want to postpone parenthood.Young women with tumor will be the main population of fertility preservation because radiotherapy and chemotherapy always impaire their fertility and living quality.There are three kinds of fertility preservation technology:embryo freezing，oocyte freezing and ovarian tissue cryopreservation.The technology of embryo freezing has been successfully used in clinical practice. The technology of oocyte freezing is gettingmature.However，the technology of ovarian tissue cryopreservation is still at the early stage of research.Both of slow-freezingmethod and virtificationmethod can be applied in fertility preservation techniques，with own advantages and disadvantages.The paper mainly introduces the methods of fertility preservation and the problems needed to be solved.

【Keywords】Female；Fertility；Cryopreservation；Oocytes；Neoplasms

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：409-412）

由于生活環(huán)境及生活習慣的改變、晚婚晚育、卵巢功能不全發(fā)病率升高、腫瘤患者年輕化等因素，人類生育能力不斷下降。尤其對于腫瘤患者來說，化療、放療仍是重要的輔助治療方法，可以延長患者的生存期，同時也明顯降低生育力，其中包括內(nèi)分泌變化、性腺功能受損、卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI），甚至卵巢功能早衰［1］。研究發(fā)現(xiàn)，超過1/3的年輕女性腫瘤患者經(jīng)過放化療后會發(fā)生卵巢功能早衰，而且呈逐年上升趨勢，因此在放化療前對這些患者進行生育力保存成為解決這些患者生育問題的重要方法［2］。本文主要對生育力保存的適用人群、保存方法、保存方式等進行闡述，從而增強臨床醫(yī)師的生育力保存意識，并為進一步研究提供更多的思路。

1　生育力保存適用范圍

1.1POI患者當成年女性閉經(jīng)時間＞4個月，年齡＜40歲，血清卵泡刺激素（FSH）水平＞35 IU/L時稱為POI。POI可導致女性不孕，大大降低生育能力?；颊叽蠖鄶?shù)為特發(fā)性，常見病因有基因異常、自身免疫異常、醫(yī)源性因素（盆腔手術、放療、化療）、感染因素等［3］。Christin-Maitre等［4］研究發(fā)現(xiàn)POI發(fā)病率正逐年增加，目前發(fā)病率已高達1%～3%，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。有研究表明，POI患者可通過將卵巢組織冷凍保存，然后適時解凍并體外激活（in vitro activation，IVA）使靜止期的卵泡進入發(fā)育期，然后進行自體移植，從而獲得生育力保存［3］。因此，如果年輕患者確診為POI，且患者有生育要求，可以通過卵巢組織冷凍自體移植或卵子冷凍進行生育力保存［5］。

1.2腫瘤患者育齡期女性一經(jīng)診斷患有腫瘤，大多數(shù)患者需進行放療或化療，但放化療會造成患者生育能力下降，包括卵巢功能早衰、女性內(nèi)分泌改變等，因此這類腫瘤患者是生育力保存的主要目標人群［2］。生育力保存的問題在進行放化療前即應考慮。生育期的女性腫瘤患者，根據(jù)疾病治療的迫切性、治療方案、患者年齡、婚姻狀況等不同情況，生育力保存方案應實現(xiàn)個體化。并且這個過程需要多個學科（包括婦產(chǎn)科、腫瘤科、生殖醫(yī)學科）以及患者之間密切合作。一般認為，如果患者治療前時間允許可以進行超促排卵、取卵，之后根據(jù)患者婚姻狀況及意愿來選擇卵子冷凍或胚胎冷凍。如果患者治療時間不能推遲或者患有基礎疾病不宜進行卵巢刺激，冷凍卵巢組織則成為首選方案。例如患淋巴瘤、白血病等血液病的育齡期女性，由于治療需要立即進行，卵巢組織冷凍為最佳選擇。對于乳腺癌患者，生育力保存的最佳時間是手術后到放化療之前，因此可以進行胚胎冷凍或者卵母細胞的冷凍。但這2種冷凍方法需要控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS），而COS會使雌二醇水平升高可能影響患者病情發(fā)展，因此治療前一定要多學科醫(yī)師進行討論以尋找最佳方案［6］。對于青春期前女性腫瘤患者，由于其尚未建立下丘腦-垂體-卵巢軸功能，如果想要保存生育能力，卵巢組織冷凍為最佳方案［7-8］。

1.3自身免疫性疾病嚴重的自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、血管炎等，經(jīng)過免疫抑制藥物的治療，尤其是環(huán)磷酰胺，在延長患者生存時間的同時，具有性腺毒性，可導致女性患者POI高發(fā)生率、不可逆轉(zhuǎn)的閉經(jīng)和不孕［9］。因此，自身免疫性疾病可在治療前選擇COS進行卵子冷凍或胚胎冷凍，亦可選擇冷凍卵巢組織來進行生育力保存。

1.4欲將生育時間延后的人群許多女性因工作原因或自身因素等欲推遲生育時間，但是高齡孕育會產(chǎn)生許多問題。隨著年齡增長，女性卵巢功能逐漸衰退，卵子質(zhì)量亦逐漸下降，而且胚胎染色體異常發(fā)生率增加，進而增加了流產(chǎn)及孕育畸胎的風險。因此年輕時保存生育力成為這部分女性的選擇。根據(jù)患者婚姻狀況、法律法規(guī)、倫理原則等可選擇卵子冷凍或胚胎冷凍。大多數(shù)人選擇卵子冷凍，Ter Keurst等［10］認為冷凍卵母細胞的最佳年齡是36歲前。在我國禁止對未婚女性進行輔助生殖。

2　生育力保存方法

一般多采用低溫冷凍保存的方法進行生育力保存，因此冷凍過程至關重要。若直接凍存細胞時，細胞內(nèi)、外環(huán)境中的水分會形成冰晶，將導致細胞內(nèi)發(fā)生一系列的變化，比如破壞細胞基質(zhì)及細胞膜、破壞細胞結構、使電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、pH值改變、蛋白質(zhì)變性等，最終造成細胞的死亡［11］。冷凍時加入冷凍保護劑可減少對細胞的損傷。冷凍保護劑與溶液中的水分子結合，發(fā)生水化作用，弱水化的結晶過程使溶液的黏性增加，從而減少冰晶的形成。同時冷凍保護劑可滲透細胞內(nèi)以維持細胞內(nèi)外穩(wěn)定的滲透壓，降低細胞內(nèi)外未結晶溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷。冷凍保護劑根據(jù)其是否能夠穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細胞膜滲透到細胞內(nèi)。該類保護劑主要包括二甲基亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇等。非滲透性冷凍保護劑一般是大分子物質(zhì)，不能滲透到細胞內(nèi)，該類保護劑主要包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮等。兩類保護劑同時使用冷凍效果更好。慢速程序化及玻璃化冷凍是目前常用的兩種冷凍方法。

2.1慢速程序化冷凍多應用丙二醇和蔗糖作為冷凍保護劑，在緩慢降溫的過程中讓細胞逐步充分脫水，當細胞內(nèi)水分被冷凍保護劑替代后，細胞內(nèi)液的凝固點降低，在適當溫度進行人工輔助植冰，然后在溫度逐漸降至-35℃～-70℃時直接投入液氮（-196℃）中保存，人工輔助植冰是促使溶液結晶的方法，目的是為了誘導細胞內(nèi)外冰晶逐漸形成，從而使細胞進一步脫水，防止過冷現(xiàn)象的發(fā)生。目前世界上公認最佳的植冰溫度是-7℃［11］。

2.2玻璃化冷凍應用高濃度的冷凍保護劑溶液，如乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖等使細胞快速脫水，然后大約以-15 000℃/min的速度急速降溫至-196℃，使細胞內(nèi)外的液體狀態(tài)迅速轉(zhuǎn)化為外形似玻璃的固體狀態(tài)，因此稱為玻璃化冷凍。由于玻璃化的液體在低溫時黏稠度很高，保留了細胞內(nèi)外液體正常的分子和離子分布，因而不產(chǎn)生冰晶，避免了冰晶造成的冷凍損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍與慢速程序化冷凍相比具有一定的優(yōu)勢。玻璃化冷凍是一種快速的方法，不需要使用特殊的設備，節(jié)省時間和成本，尤其適用于整個卵巢組織的冷凍［12-13］。慢速冷凍步驟繁瑣，耗時較長，所需設備昂貴，冷凍過程易產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶［11］。有研究顯示玻璃化冷凍的卵子形態(tài)學更加完整，細胞器的生理機能包括Ca2+信號傳導更加完善［14］。玻璃化冷凍對卵母細胞發(fā)育能力的損害更小、對細胞基質(zhì)的保護性更強，對MⅡ期卵母細胞的基因表達譜的影響更小［15］。同樣在胚胎冷凍方面，玻璃化冷凍亦優(yōu)于慢速程序化冷凍。對于卵裂期胚胎，玻璃化冷凍有更高的復蘇率及更好的臨床結局［16］。Zander-Fox等［17］認為玻璃化冷凍復蘇后桑葚胚和早期囊胚的生存率、早期囊胚的發(fā)育情況均顯著優(yōu)于慢速程序化冷凍。對于卵巢組織冷凍，玻璃化冷凍對卵巢組織有更好的保護作用，卵巢間質(zhì)形態(tài)的完整性更好，可作為替代慢速冷凍的較好選擇［13，18］。Herraiz等［19］研究亦發(fā)現(xiàn)使用玻璃化冷凍不會影響卵巢組織正常形態(tài)、毛囊和血管的分布，優(yōu)于慢速程序化冷凍。

3　生育力保存方式

3.1胚胎冷凍在體外受精-胚胎移植技術中，由于使用大量促排卵藥物，會得到多枚卵子及胚胎，移植后剩余的胚胎即可進行冷凍保存，然后適時解凍并再次移植到女性子宮。胚胎冷凍技術成熟，無論是慢速程序化冷凍還是玻璃化冷凍，均能獲得較為理想的復蘇率和妊娠率。該技術可以有效減少患者超促排卵次數(shù)，目前已廣泛應用于臨床。胚胎冷凍適用于生育期已婚婦女，包括癌癥患者放化療前［20］。

3.2卵母細胞冷凍卵母細胞冷凍技術適用于以下情況：①體外受精過程中因各種原因?qū)е氯÷旬斎詹荒塬@得精子進行受精。②由于各種原因欲推遲生育年齡的女性。③有卵巢功能早衰風險的女性。④癌癥患者放化療前。Chen［11］于1986年報道首例卵子冷凍復蘇成功病例，隨后許多生殖中心開始陸續(xù)開展此項冷凍技術。但是由于卵母細胞結構的特殊性造成其冷凍技術比冷凍胚胎難度加大，因此卵母細胞復蘇率和臨床妊娠率都較低。隨著玻璃化冷凍技術日趨成熟，卵母細胞冷凍技術亦逐步改善，使得該技術應用越來越廣泛。卵母細胞冷凍在未成熟卵母細胞和成熟卵母細胞均有嘗試，Lee等［21］研究發(fā)現(xiàn)先將GV期、MⅠ期卵母細胞體外培養(yǎng)至MⅡ期再進行冷凍效果更佳。因此，目前大多數(shù)胚胎學家傾向于冷凍成熟的卵母細胞。雖然玻璃化冷凍使卵母細胞冷凍技術日趨成熟，但是由于卵母細胞對溫度異常敏感，特別是在冷凍、解凍過程中易導致減數(shù)分裂過程中的紡錘體去極化、染色單體分離異常而產(chǎn)生非整倍體，因此這一技術尚需進一步完善。

3.3卵巢組織冷凍卵巢組織冷凍和移植為需放化療的腫瘤患者帶來了生育力保存的福音，尤其是青春期前的年輕女性腫瘤患者，卵巢組織的冷凍成為她們生育力保存的唯一希望。卵巢組織冷凍使數(shù)以千計的卵母細胞保存起來，可以通過卵巢組織自體移植使卵巢功能得到恢復。由于卵巢組織冷凍要通過手術獲得卵巢組織，因此該方法主要應用于患有腫瘤和自身免疫性疾病的患者。

卵巢組織冷凍主要冷凍保存卵巢的皮質(zhì)組織，因為冷凍整個卵巢組織非常困難，主要是由于整個卵巢組織對冷凍劑的輸注和擴散具有局限性［22］。目前的研究主要是卵巢皮質(zhì)片段冷凍及移植，具有取材容易、體積小、冷凍保護劑易于滲透、可多次移植等特點。2004年，卵巢組織冷凍移植使癌癥患者生出健康嬰兒成為現(xiàn)實［23］。據(jù)報道，截止到2013年，卵巢組織冷凍的自體移植已成功應用于60例腫瘤患者［24］，到2015年，分娩超過40例嬰兒［25］。

盡管卵巢組織冷凍保存了腫瘤患者的生育力，但生育力重建仍存在許多問題。主要問題在于卵巢組織冷凍的損傷及移植后在血管再生期間由于缺血造成的大量卵泡凋亡。此外，移植后卵巢的壽命、移植多少卵巢組織最為理想、癌癥患者經(jīng)過放化療后自體移植是否發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、冷凍方案的選擇、冷凍期間是否存在組織間的污染等均是亟待解決的問題。

4　結語

總之，女性生育力保存已經(jīng)被越來越多的人關注，胚胎冷凍技術比較成熟已應用于臨床，但仍受到倫理、道德、宗教的限制。卵母細胞冷凍技術日趨成熟且為建立卵子庫提供了可能性，對那些欲推遲生育年齡的女性是不錯的選擇，但是對未婚女性卵子冷凍尚有法律法規(guī)的限制及存在倫理上的爭議。卵巢組織的冷凍是年輕女性腫瘤患者的首選，應用前景甚廣，但是仍處于實驗階段。卵巢組織冷凍的損傷以及移植后卵泡凋亡、組織的缺血損傷等使卵巢組織的冷凍和移植面臨巨大的困難。提高冷凍技術、減少復蘇后卵泡凋亡數(shù)量、改善移植后組織血運狀況等問題，需要研究人員在今后的基礎研究和臨床工作中逐步解決。隨著研究的不斷深入，相信有更多的女性會受益于生育力保存技術。

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Research Progress of Female Fertility Preservation

LI Wei，ZHANG Na.
Department of Reproductive Medicine，The Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China
Corresponding author:ZHANGNa，E-mail:13833116806@163.com

2016-06-23）

［本文編輯秦娟］

050011石家莊，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生殖醫(yī)學科

張娜，E-mail：13833116806@163.com

△審校者