梅　玫 綜述，羅　雁，劉會領(lǐng) 審校

(天津市海河醫(yī)院　300350)

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·綜述·

腸結(jié)核實驗室檢查的臨床應(yīng)用進展*

梅玫 綜述，羅雁，劉會領(lǐng) 審校

(天津市海河醫(yī)院300350)

腸結(jié)核；實驗室檢查；臨床應(yīng)用

隨著人類免疫缺陷病病毒感染和免疫抑制劑的使用，結(jié)核感染的范圍日趨擴大，腸結(jié)核(ITB)也日趨頻繁，ITB是重要的肺外結(jié)核病之一，占結(jié)核病的1%～3%[1]。它是由結(jié)核分枝桿菌侵襲腸道引起的慢性特異性感染，主要影響回腸和結(jié)腸，回腸末端病變最為常見，導(dǎo)致胃腸道癥狀如腹痛、腹瀉、便秘等臨床表現(xiàn)。ITB的診斷依據(jù)為腸道病變組織中發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌、典型的干酪樣壞死表現(xiàn)及抗結(jié)核治療有效。由于內(nèi)鏡下取材的局限性及患者合并免疫性疾病的原因，組織病理表現(xiàn)不典型，試驗性抗結(jié)核治療耗時較長，臨床上ITB的診斷仍依賴于病原學(xué)及實驗室檢查。本文對ITB的實驗室檢查進展綜述如下。

1　病原學(xué)檢查

1.1常規(guī)細菌學(xué)診斷方法：抗酸染色及結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)核桿菌涂片是指對黏膜組織進行研磨處理成液體標(biāo)本，涂在新載玻片上，參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》對涂片進行抗酸染色，顯微鏡下觀察。研究報道ITB中抗酸染色陽性率低，程潔等[2]對67例腸結(jié)核患者進行腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌9例，陽性率為13.4%，為了提高涂片的陽性率，臨床上出現(xiàn)了一些改良涂片方法，如夾層杯法、沉淀集菌法、改良萋-納染色法。王鼎鑫等[3]對16例ITB活檢組織進行改良萋-納染色法，12例找到結(jié)核分枝桿菌，該方法簡單易行，2～3 h出結(jié)果?？顾崛旧珯z查臨床中常規(guī)使用，但陽性率偏低，不同研究陽性率變異較大，且不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，不能區(qū)分是否是具有活力的分枝桿菌。雖然特異性較高，仍有研究顯示，克隆恩腸病腸黏膜中偶有抗酸染色陽性，后經(jīng)培養(yǎng)證實為非結(jié)核分枝桿菌，因此對結(jié)核病的診斷有一定的局限性。

結(jié)核桿菌培養(yǎng)是指病變腸黏膜組織液于羅氏培養(yǎng)基上孵育，觀察結(jié)核桿菌存活情況，可反映結(jié)核桿菌的存活能力，且可在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進一步做菌種鑒定和藥敏試驗。其陽性率較單純抗酸染色高，提高了對ITB的敏感性和特異性。Sekine等[4]對50例腸結(jié)核，138例非結(jié)核性腸道疾病患者進行內(nèi)鏡下黏膜活檢并行結(jié)核桿菌相關(guān)檢查，腸結(jié)核組腸黏膜抗酸染色陽性率為38%，培養(yǎng)為50%，非腸結(jié)核組陽性率為0，但該檢查耗時較長，平均2～8周。因此結(jié)核桿菌培養(yǎng)在ITB快速診斷中價值受到一定限制。

1.2分子生物學(xué)診斷方法

1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR技術(shù)用于檢測標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA的含量，采用PCR技術(shù)原理和結(jié)核桿菌特異性引物，模擬復(fù)制過程并進行體外核酸擴增，以確定患者感染結(jié)核桿菌?？墒购芪⒘康陌蠨NA在短時間內(nèi)擴增至106倍以上，是目前檢測最靈敏的方法之一。本方法可在l d內(nèi)完成，具有快速、高效、特異性強、敏感性高的優(yōu)點。Epstein等[5]報道該技術(shù)在活檢組織檢測敏感性為22%～75%，假陽性率為0%～5%,甘華田等[6]報道，PCR檢測腸黏膜組織結(jié)核桿菌DNA陽性率為71.4%。局限性在于只能定性檢測，無法提示標(biāo)本中結(jié)核桿菌的具體水平且不能進行藥物敏感試驗，而且對標(biāo)本質(zhì)量、實驗室的設(shè)備、環(huán)境要求較高，若臨床操作不規(guī)范或設(shè)備不完善均可能造成假陽性。

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(FQ-PCR)對結(jié)核檢測敏感性及特異性明顯提高。FQ-PCR技術(shù)融匯了PCR 技術(shù)的核酸高效擴增、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點,直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。FQ-PCR技術(shù)使PCR擴增、熒光探針雜交及信號檢測在單一管內(nèi)完成，既簡化了操作步驟，又消除了非特異性擴增和產(chǎn)物污染，大大減少了假陽性的出現(xiàn)。崔金環(huán)等[7]對233例石蠟包埋組織進行該項檢測，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核組織中的敏感性高達82.95%，遠遠高于抗酸染色及病理陽性結(jié)果，特異度為98.08%，高于單純PCR技術(shù)。顧清等[8]對36例ITB內(nèi)鏡活檢標(biāo)本進行FQ-PCR檢測(其中部分為蠟塊固定標(biāo)本)，23例結(jié)果陽性，對ITB診斷的敏感性為63.89%,特異性83.33%。FQ-PCR檢測TB-DNA是1種快速有效的ITB診斷方法,其定量范圍廣,檢測敏感性高。對活檢組織少、病理改變不典型、抗酸染色陰性組織的診斷和鑒別診斷尤有意義，適用于腸結(jié)核的早期診治。

1.2.2Xpert MTB/RIF檢測近年出現(xiàn)1種新型分子生物學(xué)診斷方法Xpert MTB/RIF檢測，它是以半巢式實時熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥決定區(qū)rpoB基因為靶基因，設(shè)定引物、探針，并進行擴增檢測，整個過程只需把處理好的檢測標(biāo)本放入試劑盒中，系統(tǒng)會自動運行并檢測標(biāo)本是否含有結(jié)核分枝桿菌及對利福平耐藥與否[9]。Xpert MTB/RIF試驗診斷肺結(jié)核的敏感性和特異性分別為90%和98%，可較好篩查和排除肺結(jié)核，敏感性與結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)基本一致，且大大縮短診斷時間，因此應(yīng)用廣泛[10]。

肺外結(jié)核中，多項研究顯示有較高的臨床價值，有學(xué)者對761例肺外結(jié)核(其中48例為ITB，取病變腸黏膜組織為標(biāo)本)分析發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF診斷肺外結(jié)核敏感性高達90.68%，特異性99.62%[11]。賈留群等[12]對8篇有關(guān)Xpert MTB/RIF試驗在肺外結(jié)核診斷中應(yīng)用的研究進行Meta分析，結(jié)果顯示其對肺外結(jié)核匯總的敏感性為0.78(95%CI：0.75～0.81)、特異性為0.99(95%CI：0.99～1.00)。通過亞組分析發(fā)現(xiàn)其在診斷不同器官的肺外結(jié)核中具有不同診斷價值，且差異較大，這可能與肺外結(jié)核病患者的不同部位標(biāo)本中包含結(jié)核菌數(shù)量不同有關(guān)?？紤]到不同的體液標(biāo)本或者組織標(biāo)本在Xpert MTB/RIF試驗中陽性率有所差異，Xpert MTB/RIF試驗的診斷價值可根據(jù)不同類型的肺外結(jié)核病或者不同的標(biāo)本做進一步的研究，有關(guān)Xpert MTB/RIF試驗在ITB中應(yīng)用的研究報道較少，特別是腸黏膜病變組織中的檢測。國內(nèi)未見腸黏膜組織行Xpert MTB/RIF檢查的相關(guān)報道。目前ITB病原學(xué)診斷還沒有理想的檢測方法，可以將Xpert MTB/RIF檢查應(yīng)用于ITB的診斷，并作進一步臨床觀察。

Xpert MTB/RIF試驗除了用于結(jié)核桿菌的感染還可以檢測結(jié)核桿菌對利福平耐藥情況。張治國等[10]研究顯示，以比例法藥敏試驗為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥的敏感性和特異性分別為89．1%、96．3%，楊蘊華等[13]對1 128例結(jié)核患者研究發(fā)現(xiàn)以傳統(tǒng)藥敏方法為標(biāo)準(zhǔn),Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性的敏感性89.5%，特異性為97.6%，Xpert MTB/RIF檢測可以很好地診斷初診患者是否對利福平耐藥，對抗結(jié)核治療提供參考，理論上對腸結(jié)核的早期診治有一定的輔助作用，但還需要進一步大樣本研究。

2　免疫學(xué)診斷方法

2.1結(jié)核抗體(TB-Ab)的檢測結(jié)核病是1種以細胞免疫為主的疾病，阿拉伯甘露聚糖(LAM)是結(jié)核桿菌細胞壁的主要組成成分之一，具有較強的免疫原性，特異性較強，可作為結(jié)核病抗體檢測的特異性抗原。臨床中檢測結(jié)核分枝桿菌特異性膜蛋白抗體(TB-Ab)作為診斷結(jié)核的1個特異性的病因?qū)W檢測指標(biāo)，在結(jié)核病的診斷中具有一定的臨床價值。其陽性率相對較高，在未對樣本進行選擇的情況下陽性率仍高達52.45%[14]。文獻顯示，結(jié)核患者血清結(jié)核抗體敏感性為71.5%，特異性為90.5%，其不僅在血清中存在，在病變的胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液中陽性率更高，特異性更強，是肺外結(jié)核診斷的重要輔助指標(biāo)[15]。

本方法簡單快捷，對結(jié)核病診斷和鑒別診斷起到重要輔助作用。但在免疫功能低下患者中，或處于臨床感染初期，即處于感染窗口期患者中可能出現(xiàn)假陰性情況，人自然感染結(jié)核后存在一定水平抗體，打過卡介苗或得過結(jié)核現(xiàn)已經(jīng)鈣化的患者中仍可檢測到陽性結(jié)果，故存在假陽性情況，不能對結(jié)核活動做出判斷，故臨床上多與其他檢測結(jié)果聯(lián)合使用。

2.2腺苷脫氨酶(ADA)檢測ADA是1種核酸分解的代謝酶類，可特異性催化腺嘌呤核苷產(chǎn)生不可逆脫氨反應(yīng)，參與前T細胞分化為淋巴細胞的過程，與淋巴細胞激活與分化有關(guān)，故肺外結(jié)核時，相應(yīng)部位的積液中ADA含量更高。研究顯示，結(jié)核性胸腔積液進行ADA檢測，其敏感性為88.7%，特異性為93.3%，準(zhǔn)確性為90.2%。重癥肺結(jié)核患者血清ADA活性升高，但血液病、肝硬化、SLE、糖尿病腎病，ADA的活性也升高[16]。且試驗易受溶血等因素的影響，其特異性不強。但胸腔積液、腹腔積液等的ADA檢測可作為結(jié)核性胸膜炎等肺外結(jié)核病的輔助診斷指標(biāo)之一[17]。因為檢測血、積液中的結(jié)核菌抗體、ADA的生化指標(biāo)簡單、經(jīng)濟、快速，一些研究顯示將這些指標(biāo)進行計算、聯(lián)合能提高疾病診斷的敏感性及特異性。

2.3T-SPOT試驗T-SPOT試驗是用ELISA從單細胞水平檢測細胞因子的1種細胞免疫學(xué)技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌中產(chǎn)生RD1編碼的培養(yǎng)濾過蛋白10(CFP-10)及早期分泌的抗原靶點6(ESAT-6)兩種蛋白多肽，為結(jié)核菌所特有。T-SPOT中，結(jié)核感染者外周血T淋巴細胞被ESAT-6和CFP-10兩種優(yōu)化的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原活化后分泌IFN-γ，后者與微孔板上IFN-γ抗體結(jié)合，顯色形成色素沉淀斑點，從而診斷結(jié)核感染[18]。健康者及非結(jié)核感染者外周血T淋巴細胞不會產(chǎn)生IFN-γ，理論上而言T-SPOT對結(jié)核感染應(yīng)具有一定的特異性，在腸結(jié)核的診斷及鑒別診斷中有重要作用。1篇包括12項研究的Meta分析顯示，T-SPOT鑒別CD、ITB總的敏感性和特異性分別為82.8%(95%CI，78.4%～86.6%)和86.7%(95%CI，83.2%～89.6%)[19]。雷少妮等[20]研究顯示，T-SPOT檢測ITB時敏感性及特異性分別為85.7%(12/14)和93.3%(14/15)，有助于與腸道Crohn病相鑒別?？傊?，T-SPOT試驗可提高結(jié)核感染診斷效率，尤其適合腸結(jié)核的快速診斷及鑒別診斷。

綜上所述，目前各項診斷技術(shù)在腸結(jié)核的診斷中都有其臨床價值，單一的檢查項目影響因素較多，已有相關(guān)研究將以上多項指標(biāo)聯(lián)合起來，甚至做成預(yù)測模型用于腸結(jié)核的診斷，提高疾病的診斷率[21]。由于腸結(jié)核診斷困難，快速而準(zhǔn)確的診斷疾病是實驗室發(fā)展的迫切需求，新的診斷技術(shù)的出現(xiàn)是急需的。本文中總結(jié)的結(jié)核診斷相關(guān)技術(shù)有些在腸結(jié)核的診斷中應(yīng)用觀察較少，有些研究納入病例數(shù)較少，臨床中缺少大規(guī)模多中心隨機對照研究，因此各項檢查在腸結(jié)核診治中的詳細作用仍需進一步觀察總結(jié)。

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A

1673-4130(2016)18-2587-03

2016-04-29

2016-07-07)