張　敏,吳　江

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣東　湛江　524000)

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先天性巨結腸遺傳分子學研究新進展*

張敏,吳江

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣東湛江524000)

關鍵詞：先天性巨結腸;遺傳;分子學

先天性巨結腸又稱無神經節(jié)細胞癥，是小兒消化道發(fā)育常見的畸形，主要病理學改變是狹窄段的腸管黏膜下及肌層神經叢的神經細胞完全缺乏。其發(fā)病機制為胚胎發(fā)育時期，受遺傳因素及環(huán)境因素的共同作用導致的神經嵴向腸管的定向遷移障礙[1]，而遺傳因素最為重要。近年來，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種基因與先天性巨結腸的發(fā)病關系密切，現(xiàn)綜述如下。

1RET原癌基因

RET原癌基因首次發(fā)現(xiàn)于上世紀80年代在重組DNA的實驗中，1994年以后國外開始認識到RER基因與先天性巨結腸的發(fā)病有關,并進行了相關研究。RET基因定位于染色體10q 11.2, 包含21個外顯子，編碼酪氨酸激酶受體, 傳遞與細胞生長分化增殖和凋亡有關的信號， 目前認為是主要的 HD致病基因,且也是研究HD最多及較充分的基因之一。通常需要通過2 種配體共同協(xié)同作用(GDNF-GFR oL-1-RET )，在腸神經系統(tǒng)和腎臟的發(fā)育分化中起主導作用。Schuhard等利用基因敲除技術證實RET基因與先天性巨結腸發(fā)生有關[2]。RET基因突變常見于家族性及長段型先天性巨結腸，其突變后會引起信息導通路的障礙，導致胎兒胚胎期神經嵴細胞移行、分化異常而致病[3]。而先天性巨結腸的發(fā)生正是神經節(jié)細胞在胚胎期移行受阻引起的[3]。而RER基因突變在家族性HD中占50%，在散發(fā)病例中占20%左右。有研究顯示：RET基因在HD中的表達從擴張段至狹窄段逐漸減少，當表達量減少一半時，神經嵴細胞就不能移行到腸壁內，也可說明先天性巨結腸的發(fā)生與RET基因有關[4]。

2SOX10基因

SOX10位于人類染色體22q13，主要特征是含有一個保守的HMG box DNA結合域。其編碼的轉錄因子在胚胎期的神經嵴細胞內有表達。這種現(xiàn)象發(fā)生在神經嵴細胞從外胚層分離之前。此后，SOX10在神經嵴細胞遷移過程中被轉錄。SOX10基因突變可能會引起編碼蛋白質DNA結合區(qū)域發(fā)生改變，以致不能與相應的DNA結合而引起其調控的下游基因不能正常轉錄，從而導致表達的缺失。SOX10在神經嵴細胞早期發(fā)育過程中及胚胎期和成人期的外周和中樞神經系統(tǒng)的神經膠質細胞中的表達呈現(xiàn)選擇性[5]，這說明SOX10對非常早期的多能神經嵴源性祖細胞的存活和發(fā)育是所必需的。有研究證實，Waardenbur(wS4)患者中存在 SOX10 基因突變，提示該基因對于早期神經嵴細胞系向腸神經節(jié)的分化起調控和信號轉導作用[6]。李新寧等[7]研究證實SOX10 mRNA在先天性巨結腸患兒的腸痙攣段表達最少，在移行段、擴張段遞增，且擴張段和正常(非HD患兒)結腸平滑肌組織中的表達無顯著性差異。然而，SOX10 mRNA在末端腸管均有表達，可能存在能被SOX10處理的神經營養(yǎng)因子或乙酰膽堿脂酶受體相互作用，刺激無神經節(jié)腸管中類膽堿能和其他興奮性神經纖維生長。

3GDNF

GDNF基因位于5號染色體上，是神經元和腸道神經節(jié)細胞的營養(yǎng)和生長因子。其表達于神經膠質細胞中,是轉化生長因子13超家族成員中的一員，是RET的配體。GDNF是一種膜外蛋白，無法單獨完成信號傳導。當GDNF與受體結合后，與RET共同作用，能參與細胞內外間的信號傳導。由于GDNF不僅對中樞神經系統(tǒng)的神經元具有營養(yǎng)和保護作用，而且對胃腸道神經元、周圍自主神經及感覺神經元等多種神經元都有營養(yǎng)及保護作用[8]，因此對神經的發(fā)育至關重要。候豫等[9]從轉錄水平證實GDNF mRNA在先天性巨結腸的狹窄段及移行段表達異常，證實了GDNF的減少與腸神經細胞的缺失有關。若GDNF表達缺失或者減少，則會中斷信號的傳導，導致神經嵴細胞在之后的分化、遷移過程中發(fā)生障礙，形成HD。然而GDNF表達量的改變與先天性巨結腸的因果關系還有待進一步研究。

4EDNRB與EDN3

EDNRB基因位于13q 22,約24 kd,含7個外顯子和6個內含子，編碼含442個氨基酸的功能蛋白質，該蛋白對腸神經的移行、發(fā)育非常重要。EDNRB與EDN結合,促進Ca2+內流，參與細胞內信號傳導，對腸神經節(jié)細胞的正常分化發(fā)育形成有重要作用。黃建飛等[10]通過免疫組化技術，發(fā)現(xiàn)EDNRB在先天性巨結腸腸肌間神經叢、黏膜下層及黏膜下的血管組織內上，尤其是血管內皮上有表達，且EDNRB 在常見型先天性巨結腸中的表達高于長段、短段型 HD。且還發(fā)現(xiàn)長段、短段型HD會出現(xiàn)EDNRB缺失，證實EDNRB與部分HD 的形成有關，且提示了EDNRF的表達程度與先天性巨結腸的類型有關。EDNRB基因突變常見于短段型先天性巨結腸，且發(fā)生突變后常伴有其他神經嵴病。

EDN3位于人染色體20q 13.2～13.3，編碼238個氨基酸的前體物質，EDN3存在于腸神經細胞和消化道間充質細胞中,能調節(jié)神經細胞和消化道間充質細胞間的作用,是正常神經節(jié)細胞發(fā)育所需的。EDN3在HD的類型中短段型表達較常見型HD腸段表達少。盡管國內外對EDN3基因的突變研究較多,但對其HD患者結腸中表達情況研究較少。馬能強[11]通過收集散在HD標本，檢測到EDN3在先天性巨結腸的擴張段及痙攣段相對于對照組表達均減少，且在痙攣段表達最少。Sandgren 等[12]應用EDN3基因缺失的HD小鼠模型，移植平滑肌細胞和腸肌層神經節(jié)細胞到病變的腸管，取得了良好的治療效果。

EDN3突變率與EDNRB基因相近，均表達于血管內皮上。EDNRB、EDN3 在不同類型HD中表達程度不同，兩者可作為臨床病理免疫組化診斷HD的重要指標。

5SIP1

SIP1由位于2q 22區(qū)的ZFHXlB基因編碼，長約70 kb，含10個外顯子和9個內含子，由1 214個氨基酸組成。伍美等[13]應用qRT-PCR、免疫組化和Westen Blot方法，觀察到先天性巨結腸狹窄段SIP1蛋白表達顯著高于正常段腸管的表達水平。推測SIP1基因與小兒消化道發(fā)育有關，且為診斷和了解HD的病理生理改變提供了幫助。高紅等[14]發(fā)現(xiàn)SIP1基因突變參與先天性巨結腸的發(fā)生、發(fā)展過程中。近年來，國內關于SIP1在HD中的表達情況及SIP1基因突變情況研究甚少。以致對SIP1基因HD發(fā)生中的作用還不明確，還需要進一步研究SIP1與先天性巨結腸的作用機制，為尋找新的治療靶點提供理論基礎和實驗支持。

6P2Y1受體基因和Wnt基因

P2Y1是能引起腸功能紊亂的一個重要因子,主要傳導抑制性神經和引起腸道血管擴張。陳琦等[15]通過反轉錄(RT)-PCR檢測 P2Y1 受體基因在先天性巨結腸標本中的表達發(fā)現(xiàn)該受體基因在先天性巨結腸狹窄段表達減少。當結腸組織中P2Y1受體表達減少時， 其傳達的抑制性神經遞質會相應減少,這會引起腸道抑制性神經的作用減弱,則興奮性神經相對增強，致使腸痙攣出現(xiàn)腸狹窄。P2Y1受體還是人類血管內皮的一個主要亞型，能舒張血管。當結腸中表達量減少時，還能影響結腸的血液供應。Wnt基因屬于一種類癌基因，其突變會導致發(fā)育畸形。目前已發(fā)現(xiàn)Wnt基因家族中Wnt1、Wnt2、Wnt5b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a及Wnt10b與先天性巨結腸的發(fā)生均有關系。

7PHOX2B和 NRG1

PHOX2B基因定位與4p12，其編碼的同源域蛋白與多種非腎上腺能神經元的發(fā)育有關，在腸神經系統(tǒng)的發(fā)育過程中起重要作用[16]。有研究表明[17]PHOX2B基因突變與先天性巨結腸的發(fā)生,NRG1基因也與腸神經的發(fā)育有關。研究證實[18]NRG1基因在先天性巨結腸狹窄段與擴張段表達高于正常組織。NRG1含有21個外顯子，其中外顯子1區(qū)對基因功能產生巨大作用。該基因的表達通過miRNAs來調節(jié)。而miRNAs通過轉錄抑制mRNA來調節(jié)基因的表達。因而進一步研究與RNG1相關的miRNAs是有必要的。

雖然先天性巨結腸的病因已研究近百年，但是其發(fā)病機制仍不明確。近幾年還發(fā)現(xiàn)了GSTP1、LRP5%2F6、SFRP1及APC等基因先天性巨結腸的發(fā)生有關。目前認為是多基因、多因素引起的。且單一基因不能完全解釋其發(fā)病機理，其中一些基因的缺失或突變可導致微環(huán)境改變，從而引起神經母細胞遷移停頓，形成先天性巨結腸。目前研究已經證實基因突變是先天性巨結腸發(fā)病的主要原因。上述的基因也只能解釋部分先天性巨結腸的發(fā)病機制，還存在其他未知基因，影響腸神經節(jié)細胞的發(fā)生。然而近年來國內外對HD基因研究仍然不多，因此對基因之間的相互作用還有待于進一步研究。隨著基因研究的發(fā)展，基因治療先天性巨結腸將成為最有效且最準確的治療方案。

參考文獻：

[1]王志勇,王國斌,王繼亮,等.EDNRB基因CpG島甲基化在先天性巨結腸發(fā)病機制中作用的初步探討[J].中華小兒外科雜志,2009,30(12):849-851.

[2]SehuehardtA,D Agati V,Larsson-Blomberg L,et al.Defects in the kidney and Enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret[J].Nature,1994,27(367):380-383.

[3]許娟,魏明發(fā),史慧芬,等.先天性巨結腸RET基因突變的研究[J].中華小兒外科雜志,1999,20(1):7-8.

[4]管濤,李繼承,李民駒,等.中國人先天性巨結腸Ret基因突變家系研究[J].中華小兒外科雜志,2003,24(6):516-517.

[5]Stolt CC,Wegner M.SoxE function in vertebrate nervous system development[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(3):437-440.

[6]陳艷,馮永,楊柏球.SOX10基因新突變導致-Waardenburg綜合征2型家系的分析[J].中華耳科雜志,2010,8(4):387-391.

[7]李新寧,曾甜,莫丹,等.SOX10基因在先天性巨結腸患兒腸壁中的表達[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(23):1810-1812.

[8]Nagy N,Goldstein AM.Intestinal coelomic transplants：a novel method for studying enteric nervous system development[J].Cell Tissue Res,2006,326(1):43-55 .

[9]侯豫,楊燁,趙新,等.膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子在先天性巨結腸中的表達[J].實用兒科臨床雜志,2008,23(7):507-509．

[10]黃建飛,咸華,魯菊英,等.先天性巨結腸患者RET和血管內皮素-β的表達及其臨床意義[J].蘇州大學學報,2006,26(5):796-797.

[11]馬能強,陳琦,李勇.內皮素3基因在先天性巨結腸中的表達情況[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學,2009,21(4):373-374.

[12]Sandgren K,Ekblad E,Larssn LT.Survival of neurons and interstitial cells of Cajal after autotransplantation of m yenteric ganglia from small intestine in the lethal spotted muse[J].Padiatr Surg Int,2000,16:272-276．

[13]伍美,弭杰,高紅.SIP1基因在先天性巨結腸癥中的表達研究[J].中華小兒外科雜志,2012,33(2):92-96.

[14]高紅,伍美,張娟,等.先天性巨結腸癥SIP1基因外顯子3和外顯子4的突變分析[J].中華小兒外科雜志,2010,31(9):664-668.

[15]陳琦,趙金磊,曹振杰,等.P2Y1受體基因在先天性巨結腸中的表達及意義[J].實用小兒外科雜志,2011,7(26):513-514.

[16]Dubreuil V,Hirsch MR,Pattyn A,et al.The PHOX2B transcri ption factor coordinately regulates neuronal cell cycle exit and identity[J]．Development,2000,127:5197-5201.

[17]Min J.PHOX2B mutations in patients with Ondine Hirschspru ng disease and a review of the literature[J].Eur J Pediatr,2011,170:1267-1271.

[18]Weibing T,BoL,Xiaoqun H,et al.Aberrant high expression of NRG1 gene in Hirschsprung disease[J].Journal of Pediatric Surgery,2011,47:1694-1698.

*通訊作者：吳江，男，教授、主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：小兒外科基礎與臨床。E-mail：wujiang2630@163.com

中圖分類號：R656.9

文獻標志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0326-03

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.055

(收稿日期：2015-02-01)(責任編輯：劉仰斌)