曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心　518035)

·臨床研究·

核酸檢測(cè)方法在血液HBV-DNA檢測(cè)中的應(yīng)用

曾雪珍，葉賢林，曾勁峰

(廣東省深圳市血液中心518035)

目的研究核酸檢測(cè)方法在血液HBV-DNA檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2006年6月至2012年6月深圳市347 160例血清學(xué)檢測(cè)陰性的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本為研究對(duì)象，對(duì)其實(shí)施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查、PCR-微流芯片法、實(shí)時(shí)熒光PCR法及NOVARTIS TMA進(jìn)行核酸篩查以統(tǒng)計(jì)攜帶有HBV的血液標(biāo)本數(shù)量，同時(shí)，所有獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乙型肝炎兩對(duì)半標(biāo)志物。結(jié)果347 160例血清學(xué)檢測(cè)陰性的獻(xiàn)血者通過(guò)實(shí)施核酸檢測(cè)，共檢測(cè)出乙型肝炎表面抗原陰性及HBV-DNA陽(yáng)性129例，占0.37‰。其中，窗口期19例，占檢出總例數(shù)14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。結(jié)論NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中攜帶的HBV，對(duì)保障血液安全具有重要意義，值得在今后臨床檢測(cè)工作中積極推廣使用。

核酸擴(kuò)增技術(shù)；乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原；脫氧核糖核酸

輸血是將獻(xiàn)血者的血液通過(guò)靜脈輸注的方式傳輸至患者體內(nèi)，以起到良好的輔助治療作用的一種治療方法，在當(dāng)前醫(yī)療機(jī)構(gòu)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在獻(xiàn)血者中，乙型肝炎病毒感染組不可避免地夾雜其中，對(duì)輸血者的身體健康帶來(lái)了極大的隱患。根據(jù)當(dāng)前醫(yī)學(xué)臨床研究可知，乙型肝炎病毒(HBV)是一種脫氧核糖核酸病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[1]。目前在我國(guó)境內(nèi)HBV感染率約為65%，而乙型肝炎表面抗原攜帶率約占到了總?cè)丝跀?shù)的7%，乙型肝炎病毒(HBsAg)屬于傳染性疾病，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為嚴(yán)重的全球性衛(wèi)生問(wèn)題。如何有效降低由血液輸注造成的HBV感染率已經(jīng)成為各國(guó)醫(yī)學(xué)界專家學(xué)者研究的重要課題。在血液標(biāo)本檢測(cè)工作中，核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)可縮短檢測(cè)“窗口期”，降低漏檢感染病毒率等優(yōu)點(diǎn)日漸凸顯，并且此種方法已經(jīng)成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家病毒篩查工作的重要手段之一[2]。為此，本研究針對(duì)核酸檢測(cè)方法在血液HBV-DNA檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值展開(kāi)深入分析，以為該種檢測(cè)技術(shù)的推廣使用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取深圳市血液中心2006年6月至2012年6月347 160例血清學(xué)檢測(cè)為陰性的獻(xiàn)血者為研究對(duì)象，其中男185 470例，占53.4%，女161 690例，占46.6%，獻(xiàn)血者年齡18～45歲，平均(31.5±2.5)歲。所有無(wú)償獻(xiàn)血者均檢測(cè)HIV、梅毒陰性；ABO血型根據(jù)紅細(xì)胞表面有無(wú)特異性抗原(凝集原)A和B來(lái)劃分血液類型系統(tǒng)；血液檢測(cè)標(biāo)本均是在全密閉狀態(tài)下采集的。排除非研究區(qū)間段提供的血液標(biāo)本，以及含有乙醇成分的血液標(biāo)本。

1.2檢測(cè)方法347 160例獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg金標(biāo)試紙法，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)采用干化學(xué)法測(cè)試，合格后將采集到的血液標(biāo)本置于NAT試管中，以3 000 r/min離心15 min，并放置在4 ℃環(huán)境中保存[3]。選定后實(shí)施羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法、PCR-微流芯片法、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法及NOVARTIS TMA進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)。(1)羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法。首先對(duì)檢測(cè)血液標(biāo)本進(jìn)行核酸全自動(dòng)提取工作，將所使用的純化試劑洗滌緩沖液、蛋白裂解液、磁珠等放置在瑞士羅氏COBAS AMPLICOR NAT檢測(cè)儀上，于匯集池將標(biāo)本均勻混合后取樣500 μL,并且經(jīng)過(guò)陰陽(yáng)對(duì)照之后放入到儀器，等待1 h后提取自動(dòng)完成的核酸[4]。其次，向標(biāo)本加入Mn2+溶液和純化之后的核酸樣液，根據(jù)NAT檢測(cè)儀檢測(cè)步驟要求逐次加入變性液、內(nèi)標(biāo)、酶和顯色劑自動(dòng)完成擴(kuò)增和檢測(cè)工作，之后由操作人員記錄標(biāo)本的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。(2)PCR-微流芯片法。本研究中采用上海浩源生物科技有限公司生產(chǎn)的PCR檢測(cè)試劑盒，擴(kuò)增引物為HBV前C及C區(qū)設(shè)計(jì)引物，正反向擴(kuò)增引物的序列如下所示：5′-TTG CCT TCT GAC TTC TTT CC-3′,5′-CGA GGG AGT TCT TCT TCT AG-3′。擴(kuò)增的具體循環(huán)條件為：50 ℃環(huán)境下120 s；95 ℃環(huán)境下預(yù)變性5 min，94 ℃ 50 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s 2個(gè)循環(huán)，90 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s共32個(gè)循環(huán)[5]。使用DNA500微流芯片來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增物。利用Caliper L 1000微流芯片分析儀實(shí)施HBV定量檢測(cè)，并利用檢測(cè)儀攜帶的計(jì)算軟件計(jì)算最終檢測(cè)結(jié)果[6]。(3)實(shí)時(shí)熒光PCR法。本研究中所使用的PCR混合物包括正向引物(nt1743～1434)5′-ACG TCC TTT GTT TAC GTC GCG T-3′和反向引物(nt1743～1722)5′-CCC AAC TCC TCG CAG TCC TTA A-3′。擴(kuò)增程序：50 ℃環(huán)境下溫育120 s，94 ℃ 120 s、60 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共39次循環(huán)，在60 ℃條件下進(jìn)行熒光PCR定量分析[7]。(4)NOVARTIS TMA。采用Novartis Procleix Ultrio Discriminatory TMA對(duì)待檢測(cè)血液標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)，檢測(cè)樣品嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品HBV(97/750)進(jìn)行校準(zhǔn)。(5)HBV陽(yáng)性結(jié)果的追蹤研究。進(jìn)行乙型肝炎兩對(duì)半，ALT檢測(cè)，HBsAg同時(shí)用兩種ELISA試劑測(cè)定，陽(yáng)性結(jié)果用中和實(shí)驗(yàn)確證。

1.3質(zhì)量控制每天室內(nèi)質(zhì)控物由試劑公司合作配置，按試劑說(shuō)明書(shū)要求判讀結(jié)果有效性。2007年開(kāi)始參加原衛(wèi)生部和澳大利亞的室間質(zhì)評(píng)(NRL，2011年后更改為CITAC)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類變量資料采用Fisher法，連續(xù)變量資料采用兩獨(dú)立樣本Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1核酸檢測(cè)結(jié)果所有347 160例獻(xiàn)血者通過(guò)實(shí)施核酸檢測(cè)，共檢測(cè)出HBsAg陰性、HBV-DNA陽(yáng)性129例，占0.37‰[95%置信區(qū)間(CI)為1∶3 224～1∶2 265，P<0.05]。其中，羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，95%CI為1∶9 124～1∶1 999；實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出11例，95%CI為1∶11 779～1∶2 831；PCR-微流芯片法檢出3例，95%CI為1∶22 831～1∶1 611；NOVARTIS TMA多核酸檢測(cè)107例，95%CI為1∶2 463～1∶1 671。

2.2HBsAg陰性及HBV-DNA陽(yáng)性血清學(xué)標(biāo)志物分布情況本研究共檢測(cè)出HBsAg陰性，HBV-DNA陽(yáng)性129例。其中，處于窗口期19例，占檢出總例數(shù)的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染中乙型肝炎核心抗體(HBcAb)陽(yáng)性及乙型肝炎表面抗體(HBsAb)50例，占38.8%；HBcAb陽(yáng)性及HBsAb陽(yáng)性45例，占34.9%；單純HBsAb陽(yáng)性15例，占11.6%。

2.3對(duì)核酸陽(yáng)性結(jié)果獻(xiàn)血者的追蹤結(jié)果129例HBV-DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，成功追蹤到42例獻(xiàn)血者，其中7例獻(xiàn)血者追蹤到HBsAg血清轉(zhuǎn)換到陽(yáng)性的現(xiàn)象，且HBcAb轉(zhuǎn)換為陽(yáng)性，呈窗口期特征，占總例數(shù)的18.0%。

2.4室間質(zhì)評(píng)結(jié)果2007年開(kāi)始每年參加原衛(wèi)生部臨檢中心的質(zhì)評(píng)，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。澳大利亞的NRL共15支編號(hào)A～O，按要求與血液標(biāo)本同等檢測(cè)，2007年參加3次，其中HBV-DNA、HCV RNA與預(yù)期結(jié)果完全一致。HIV RNA 第2次N號(hào)標(biāo)本為B亞型稀釋標(biāo)本，首次未檢出，后改進(jìn)探針后檢出。2008年參加3次，全部符合，其中第一次L號(hào)為HBV和HIV合并感染，HIV載量低于目前所有的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)室均檢出。2008年后均為100.0%符合。

3討論

HBV是一種經(jīng)血傳播，且危害極大的一種病毒性傳染病，而引起HBV傳播的途徑主要有以下幾種：血源性傳播、醫(yī)源性傳播、母嬰傳播、生殖細(xì)胞傳播、密切接觸傳播(性接觸為主)、吸血昆蟲(chóng)(蚊子、臭蟲(chóng)等)傳播等[8]。隨著病毒防治及健康宣教工作的廣泛開(kāi)展，生殖細(xì)胞傳播、密切接觸傳播、吸血昆蟲(chóng)傳播等途徑所導(dǎo)致的HBV傳播率得到了有效控制。因而，血源性傳播已經(jīng)成為乙型肝炎的主要傳播途徑。特別是當(dāng)前輸血治療在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的各個(gè)科室中已經(jīng)得到了廣泛的使用，更是進(jìn)一步加劇了HBV防治工作的壓力。

當(dāng)前我國(guó)范圍內(nèi)的大部分血站一直在單純使用ELISA，并將HBsAg作為HBV感染的獻(xiàn)血者篩查手段與指標(biāo)。但是，血液標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中由于窗口期、低水平乙型肝炎感染、基因變異等客觀因素的存在，使獻(xiàn)血者篩查工作并沒(méi)有取得理想效果，現(xiàn)代輸血安全的需要得不到有效滿足[9]。所以，如何降低血站血液標(biāo)本中HBV“窗口期”感染風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)成為血液檢測(cè)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

經(jīng)過(guò)不斷開(kāi)展的臨床研究證實(shí)，人體一旦遭受到外界病毒感染，通常情況下最先被檢測(cè)出來(lái)的就是病毒核酸。HBV-DNA為乙型肝炎的脫氧核糖核酸，即HBV基因，是當(dāng)前臨床判定乙型病毒性肝炎感染的最直接、特異性較強(qiáng)及反應(yīng)靈敏度較高的指標(biāo)。如果獻(xiàn)血者血液標(biāo)本經(jīng)過(guò)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)HBV-DNA結(jié)果呈陽(yáng)性，則提示該獻(xiàn)血者體內(nèi)存在著HBV復(fù)制和潛在傳染性。而HBV-DNA越高則表示病毒基因復(fù)制越嚴(yán)重，傳染性隨之提升[10]。因此，通過(guò)檢測(cè)HBV-DNA已經(jīng)成為篩選血站血液標(biāo)本HBV感染，以及提高輸血安全性的關(guān)鍵手段。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)外醫(yī)學(xué)界已經(jīng)廣泛采用NAT來(lái)縮短病毒基因檢測(cè)的“窗口期”，實(shí)現(xiàn)及時(shí)篩查出HBV感染的血液標(biāo)本的目的。相較于ELISA等血清學(xué)檢測(cè)方法，核酸檢測(cè)將HBV檢測(cè)的 “窗口期”由原來(lái)的50 d縮短至25 d，血液安全由此可得到更好保障。國(guó)外將其應(yīng)用在臨床血液檢測(cè)工作中的報(bào)道已經(jīng)屢見(jiàn)不鮮。

本研究對(duì)347 160例陰性血樣獻(xiàn)血者在不同時(shí)間段分別采用羅氏PCR法，PCR-微流芯片法和實(shí)時(shí)熒光PCR法及NOVARTIS TMA進(jìn)行血液核酸常規(guī)篩查。共檢出129例HBV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性總比率為1∶2 691，占0.37‰，明顯高于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，主要原因是我國(guó)為肝炎的高發(fā)區(qū)，人群中HBsAg攜帶率為7.18%，HBV流行率高達(dá)60%以上。本次檢出129例HBV-DNA陽(yáng)性，其中羅氏COBAS AMPLICOR血液核酸篩查方法檢出8例，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出11例，PCR-微流芯片法檢出3例，NOVARTIS TMA多核酸檢測(cè)107例?？迫A半自動(dòng)方法由于前期采用離心富集病毒方法，該方法富集病毒效果差，檢出比率相應(yīng)比其他方法低。而NOVARTIS TMA方法由于采用單人份檢測(cè)，上樣量為500 μL，檢出的陽(yáng)性比率較其他方法高。其余方法由于標(biāo)本采集時(shí)間、取樣量、提取和擴(kuò)增方法不同，檢出比率稍有不同。盡管各種檢測(cè)方法檢出例數(shù)存在著一定程度的差異，但是不可否認(rèn)的是相較于臨床常用的ELISA，其診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性更高，對(duì)于臨床廣泛使用的輸血治療起到了有效的保障。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)出的129例HBsAg陰性、HBV-DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者，其中，窗口期患者19例，占檢出總例數(shù)的14.7%；隱匿性感染110例，占84.3%。所有110例隱匿性感染獻(xiàn)血者中HBcAb陽(yáng)性及HBsAb陰性50例，占38.8%；HBcAb陽(yáng)性及HBsAb陽(yáng)性45例，占34.9%；單純HBsAb陽(yáng)性15例，占11.6%，進(jìn)一步證實(shí)了現(xiàn)有檢測(cè)方法存在的弊端與不足。

然而，結(jié)合國(guó)內(nèi)外既有研究成果及本科室工作經(jīng)驗(yàn)，提示NAT推廣使用需要解決以下兩個(gè)問(wèn)題：首先是持續(xù)維持核酸檢測(cè)運(yùn)行經(jīng)費(fèi)問(wèn)題。NOVARTIS TMA核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果是上述檢測(cè)方法中最佳的，但是該系統(tǒng)與國(guó)內(nèi)目前血站實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)存在著明顯的數(shù)據(jù)信息對(duì)接問(wèn)題，缺乏足夠的配套資金開(kāi)展相應(yīng)的研究。其次，需要明確一個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化檢測(cè)流程并做好核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和人員的技術(shù)培訓(xùn)工作。由于NAT在國(guó)內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用，各地區(qū)醫(yī)療從業(yè)人員對(duì)其認(rèn)知與操作步驟存在一定的不足，需要在此方面花費(fèi)較大精力予以妥善解決。

綜上所述，NAT靈敏度高，能夠有效篩選出獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中攜帶的HBV，對(duì)血液安全起到了重要的保障作用，值得在今后臨床檢測(cè)工作中積極推廣使用。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.041

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1673-4130(2016)12-1695-03