王韋華，劉桂梅（陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用研究

王韋華，劉桂梅
（陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000）

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，畜牧獸醫(yī)中對(duì)動(dòng)物的檢測(cè)技術(shù)有了很大的進(jìn)步，一種名為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的分子生物檢測(cè)技術(shù)，憑借著特異性強(qiáng)、敏感度高、操作方便快捷等特點(diǎn)，正在受到越來越多生物醫(yī)學(xué)研究者所關(guān)注。研究表明，將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)英語畜牧獸醫(yī)的檢測(cè)當(dāng)中有著非常重要的實(shí)際意義。因此，本文主要就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，介紹了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的技術(shù)原理，分析了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜牧獸醫(yī)的實(shí)際應(yīng)用思路，希望通過此次研究為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)未來的深入研究和應(yīng)用提供參考和借鑒。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；畜牧獸醫(yī)；應(yīng)用

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由日本研究者Notomi等人在綜合前人的發(fā)展成果的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)基本原理是針對(duì)六個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)四條特殊引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在60～65 ℃的溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的有效擴(kuò)增。因此，憑借著環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作方便快捷等特點(diǎn)，將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)當(dāng)中將在無需借助昂貴的儀器設(shè)備的情況，更快更準(zhǔn)確的對(duì)動(dòng)物疫病做出檢測(cè)［1］。

1　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的簡(jiǎn)介

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)針對(duì)靶序列六個(gè)特定區(qū)域，我們需要設(shè)計(jì)四條特殊引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）在60～65 ℃條件下催化新鏈合成，從而達(dá)到短時(shí)間內(nèi)對(duì)核酸有效擴(kuò)增的目的。其中四條特殊的引物分為兩對(duì)內(nèi)外引物。在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)中，內(nèi)引物與目標(biāo)DNA交雜，開始互補(bǔ)鏈的合成，產(chǎn)生啞鈴狀的DNA，這種合成持續(xù)延伸，進(jìn)而形成莖環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，成為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。具體是內(nèi)引物夾雜在莖環(huán)DNA結(jié)構(gòu)上，使得引物鏈置換合成的有缺口的中間媒介，莖上附這的便是目標(biāo)序列，然后，通過外引物，在莖的末端合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，周而復(fù)始，便在同一DNA鏈上形成諸多花椰菜結(jié)構(gòu)的莖環(huán)DNA機(jī)構(gòu)。我們對(duì)經(jīng)過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后的混合物進(jìn)行電泳，由于擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，其在電泳后在凝膠上會(huì)呈現(xiàn)出不同大小區(qū)帶的階梯式圖譜，我們可以通過對(duì)圖譜的不同顯示情況來判斷動(dòng)物的疫病情況，從而達(dá)到對(duì)動(dòng)物的檢測(cè)。

2　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

首先，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以用于動(dòng)物真菌的檢測(cè)。一直以來，病毒都是導(dǎo)致動(dòng)物生病和死亡的主要原因，因此在畜牧獸醫(yī)中對(duì)動(dòng)物病毒的檢測(cè)是動(dòng)物疫病防治的只要工作之一。在畜牧獸醫(yī)中對(duì)于動(dòng)物危害最為普遍的便是禽流感，由于畜牧業(yè)動(dòng)物都比較集中，一旦發(fā)生禽流感往往會(huì)給牧民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的禽流感病毒的檢測(cè)一般是采取病毒分離的檢測(cè)方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)過長(zhǎng)一直是次檢測(cè)方法發(fā)主要弊端，此外我們也可以常規(guī)PCR等核酸診斷技術(shù)的方法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，雖然這種檢測(cè)方法敏感性高，但往往需要用到昂貴且操作復(fù)雜的儀器和試劑，對(duì)于畜牧獸醫(yī)中臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)比較困難。而在畜牧獸醫(yī)中應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，就能極大提高動(dòng)物病毒檢測(cè)的速率，且操作方便快捷，無需借助昂貴的檢測(cè)儀器便可實(shí)現(xiàn)。在對(duì)豬圓環(huán)病毒檢測(cè)時(shí)，根據(jù)豬圓環(huán)病毒與基因組的構(gòu)成針對(duì)PCV2引入四對(duì)特異性引物，在60 ℃的情況下對(duì)幼崽豬進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，若60 min內(nèi)發(fā)生反應(yīng)這證明PCV2的存在，反之則不存在。以此方法從而達(dá)到對(duì)幼崽豬PCV2的快速簡(jiǎn)單的檢測(cè)，且這種檢測(cè)方法靈敏度高，與豬的PCV1、豬偽狂犬病毒以及豬細(xì)小病毒的檢測(cè)無干擾，確保了PCV2病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性［2］。

其次，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以用于動(dòng)物細(xì)菌的檢測(cè)。動(dòng)物細(xì)菌的感染也是動(dòng)作致病的一大原因之一，其中如產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）不僅是導(dǎo)致人生病的一大細(xì)菌，也是導(dǎo)致動(dòng)物疾病產(chǎn)生的一大原因。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法一般是采取將細(xì)菌分離方法以達(dá)到檢測(cè)的目的，這種方法不僅操作復(fù)雜，花費(fèi)的時(shí)間比較久，且檢測(cè)結(jié)果容易與其他型大腸桿菌的影響［3］。

最后，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以用于動(dòng)物真菌的檢測(cè)。在畜牧獸醫(yī)中我們常常會(huì)遇到真菌檢測(cè)，比如奔馬性赭粉菌是一種不完全真菌，這種真菌是動(dòng)物性傳染病與急性真菌感染的一大根源，其對(duì)貓和鳥動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道的危害最為巨大，對(duì)用畜牧業(yè)的影響也是非常大。因此，在對(duì)動(dòng)物真菌檢測(cè)是，我應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)針對(duì)奔馬性赭粉菌DNA中LSU rDNA序列的特定區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，這種方法準(zhǔn)確且迅速，檢測(cè)結(jié)構(gòu)不易受到其他真菌的影響。

3　結(jié)束語

從上我們不難發(fā)現(xiàn)，在畜牧獸醫(yī)中應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其主要是利用病毒、細(xì)菌和真菌等DNA的特異性，引入特殊引物對(duì)其進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，這種技術(shù)不僅對(duì)動(dòng)物病毒、細(xì)菌和真菌的檢測(cè)方便迅速，且檢測(cè)結(jié)構(gòu)比起傳統(tǒng)檢測(cè)方法更為準(zhǔn)確可靠。

［1］彭永剛，孫恩成，劉飛，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，（5）.

［2］劉寶山，潘樹德，尹榮煥，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜禽疾病診斷中的應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，（7）.

［3］楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用［A］.上海是畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)［C］，2011.

（編輯：李善祥）

S851.6

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1006-799X（2016）13-0011-02