紀(jì)志華，賈丙申，于鵬，周立義，付昆，李洪潮，李君，周建強(qiáng)，李明，云大科，胡帥(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科，海南 ?？?570102)

·論 著·

TIMP2在激素性股骨頭壞死中作用的實(shí)驗(yàn)研究

紀(jì)志華，賈丙申，于鵬，周立義，付昆，李洪潮，李君，周建強(qiáng)，李明，云大科，胡帥(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科，海南 ?？?570102)

目的 觀察激素性股骨頭壞死組織中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP2)的表達(dá)情況，探討TIMP2在激素性股骨頭壞死中的作用機(jī)制。方法采用12只家兔，按照隨機(jī)數(shù)表法分為對照組和模型組，每組6只。模型組給予靜脈注射10μg·mL-1·kg-1內(nèi)毒素和肌肉注射40 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍，對照組給予等量的生理鹽水。10周后進(jìn)行X線、CT等檢查，比較兩組家兔的股骨頭標(biāo)本空骨陷窩率、髓腔脂肪面積及TIMP2表達(dá)。結(jié)果模型組家兔的空骨陷窩率為(20.26±9.83)%，髓腔脂肪面積為(236.30±34.78)μm2，X光可見股骨頭內(nèi)骨小梁稀疏，斷裂，密度不均勻等壞死表現(xiàn)，TIMP2的陽性表達(dá)率為10.5%，而對照組則分別為(3.12±1.05)%、(178.80±21.82)μm2和30.5%，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論激素性股骨頭壞死組織中的TIMP2的低表達(dá)與股骨頭壞死發(fā)生有密切關(guān)系。

激素性股骨頭壞死；組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；骨小梁

激素性股骨頭壞死(glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head，GNFH)是一種常見病，好發(fā)于中青年人，發(fā)病年齡在30～59歲，嚴(yán)重影響到人民群眾的身體健康[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase，MMPs)是參與全身各種組織，包括骨組織降解的蛋白酶家族，而組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metallo-proteinase，TIMPs)對MMPs具有明顯的調(diào)節(jié)作用，在TIMPs存在的情況下，破骨細(xì)胞的骨吸收作用明顯被抑制[2]。本研究采用內(nèi)毒素加激素的方法制作激素性股骨頭壞死模型，通過免疫組化的方法檢測TIMP2的表達(dá)，探討TIMP2在激素性股骨頭壞死中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 海南醫(yī)學(xué)院動物試驗(yàn)中心提供家兔12只，雌雄各半，平均體質(zhì)量(3.7±0.3)kg。按照隨機(jī)數(shù)表法分為對照組和模型組，每組6只。

1.2 主要儀器與試劑 奧林巴斯顯微鏡，武漢博士德生物公司TIMP2試劑盒，比利時輝瑞公司甲基強(qiáng)的松龍500 mg，Sigma公司大腸桿菌內(nèi)毒素10 mg。

1.3 模型制作 家兔左側(cè)耳緣靜脈注射內(nèi)毒素l0μg·mL-1·kg-1。隨即在左臀部按照40 mg/kg注射甲基強(qiáng)的松龍一次，右側(cè)臀部注射青霉素鈉40萬U一次預(yù)防感染。連續(xù)3 d。對照組在相同注射部位注射等量的生理鹽水。

1.4 影像學(xué)檢查及組織取材 10周后，家兔麻醉后行X光和CT檢查，見圖1。影像學(xué)檢查完畢后麻醉過量法處死動物，無菌操作，取出股骨頭，剔除軟組織，大體觀察股骨頭形態(tài)并記錄。再以冠狀面剖開股骨頭，甲醛固定、硝酸脫鈣、酒精脫水、石蠟包埋、切片及HE染色等處理后置于光鏡下，觀察骨小梁、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓脂肪細(xì)胞等形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變。并計算：①空骨陷窩率：每張切片在高倍鏡下任選10個視野，每個視野計數(shù)50個骨陷窩，分別計數(shù)其中空骨陷窩數(shù)，計算空骨陷窩率(空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)/ 50×100%)。②髓腔脂肪組織面積：任選5個高倍視野，采集圖像軟件定量分析，測量髓腔脂肪組織面積。

圖1 模型組X光及CT

1.5 免疫組化檢測 采用TIMP2試劑盒檢測TIMP2。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組家兔的一般情況比較 造模3周后動物逐漸出現(xiàn)飲食減少，精神不振，體質(zhì)量下降，并死亡1只。模型組股骨頭X線，CT及HE染色可見骨小梁稀疏，斷裂，碎片化及空骨陷窩形成，符合激素性股骨頭壞死的病理表現(xiàn)，見圖2。

圖2 HE染色(×100)

2.2 兩組家兔的空骨陷窩率和髓腔脂肪面積比較 模型組的空骨陷窩率和髓腔脂肪面積均明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

組別對照組模型組t值P值樣本量6 6空骨陷窩率(%) 3.12±1.05 20.26±9.83 -6.38＜0.05髓腔脂肪面積(μm2) 178.80±21.82 236.30±34.78 -7.88＜0.05

2.3 兩組家兔的TIMP2表達(dá)情況比較 經(jīng)過圖像分析處理后，TIMP2在模型組每百個視野的陽性表達(dá)率為19.5%，而對照組為30.5%，模型組明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 TIMP2染色(×100)

3 討 論

TIMPs是MMPs的天然內(nèi)生抑制劑，TIMP2對MMPs家族具有廣泛的抑制作用，但主要抑制MMP2，同時抑制Ⅳ型膠原的降解[3]，并且可以調(diào)節(jié)骨基質(zhì)降解的速度和數(shù)量[4]。此外，TIMP2存在的情況下，破骨細(xì)胞的骨吸收作用明顯被抑制[5]。MMPs屬細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶家族，需要鈣離子、鋅離子等金屬離子輔佐才能發(fā)揮作用，故而命名。其是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的必需酶，根據(jù)其作用底物和結(jié)構(gòu)的不同分為膠原酶，明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型金屬蛋白酶等。其中MMP2屬于明膠酶，可降解各型膠原，粘連蛋白，蛋白多糖等[6]，直接參與骨基質(zhì)降解，在骨代謝疾病中發(fā)揮重要作用。

本研究觀察到模型組空骨陷窩率明顯高于對照組(P＜0.05)，髓腔脂肪面積也明顯高于對照組(P＜0.05)。因此筆者認(rèn)為，此造模方法使兔股骨頭髓腔內(nèi)脂肪明顯增多，骨壞死明顯增多，符合股骨壞死的病理學(xué)表現(xiàn)，因此模型是成功的。模型組的TIMP2陽性表達(dá)明顯低于對照組(P＜0.05)，說明TIMP2的低表達(dá)與激素性股骨頭壞死的發(fā)生具有密切關(guān)系。

綜上所述，激素性股骨頭壞死的發(fā)生與TIMP2的低表達(dá)有密切關(guān)系。超量的糖皮質(zhì)可能通過作用于TIMP2，減少對MMP2的抑制作用，從而激活骨吸收的過程，導(dǎo)致股骨后壞死的發(fā)生。由于本研究經(jīng)費(fèi)的限制，樣本量偏小，可能存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Whittier X,Saag KG.Glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Rheum Dis Clin NorthAm,2016,42(1):177-189.

[2]Collazos J,Asensi V,Martin G,et al.The effect of gender and genetic polymorphisms on matrix metalloprotease(MMP)and tissue inhibitor(TIMP)plasma levels in different infectious and non-infectious conditions[J].Clinical and Experimental Immunology,2015,182(2): 213-219.

[3]Prideaux M,Staines KA,Jones ER,et al.MMP and TIMP temporalgene expression during osteocytogenesis[J].Gene Expr Patterns, 2015,18(1-2):29-36.

[4]Anne K,Sundeep K,Paul K.RANKL and OPG regulation of bone remodeling in health and disease[J].Endocrine Reviews,2008,29(2): 155-192

[5]Tannure PN,Küchler EC,Falagan-Lotsch P,et al.MMP13 polymorphism decreases risk for dental caries[J].Caries Res,2012,46(4): 401-407.

[6]Glueck CJ,Freiberg RA,Boppana S,et al.Thrombophilia,hypofibrinolysis,the eNOS T-786C polymorphis，and multifocal osteonecrosis[J].J Bone Joint SurgAm,2008,90(10):2220-2229.

Experimental study on the roles of TIMP2 in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head.

JI Zhi-hua,JIA Bing-shen,YU Peng,ZHOU Li-yi,FU Kun,LI Hong-chao,LI Jun,ZHOU Jian-qiang,LI Ming,YUN Da-ke,HU Shuai.Department of Joint Trauma Surgery,Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102, Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the expression of matrix metallo-proteinase inhibitor-2(TIMP2)and its roles in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head(GNFH).MethodsTwelve rabbits were randomly divided into control group and model group according to random number table,with 6 rabbits in each group.The model group was given intravenous injection of endotoxin(10μg·mL-1·kg-1)and intramuscular injection of methylprednisolone(40 mg/kg),while the control group was given equal amount of saline.The rabbits were examined by X ray and computed tomography(CT)10 weeks later.The rates of empty bone lacuna,fat area of medullary cavity and TIMP2 expression of femoral head specimens were observed and calculated.ResultsThe rate of empty bone lacuna,the fat area of medullary cavity,the positive expression rate of TIMP2 were(20.26±9.83)%,(236.30±34.78)μm2,10.5%,respectively in model group,which were significantly higher than those in control group of(3.12±1.05)%,(178.80±21.82)μm2,30.5% (P＜0.05).X ray showed necrosis manifestations of sparse bone trabecula in the femoral head,fracture and uneven density in model group.ConclusionLow expression of TIMP2 in GNFH is closely related to the occurrence of GNFH.

Glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head(GNFH);Tissue inhibitor of metallo-proteinase;Bone trabecula

R-332

A

1003—6350（2016）18—2925—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.001

2016-06-20)

海南省自然科學(xué)基金(編號：814357)

賈丙申。E-mail：jbs123@163.com