王　斌，徐綺嬪，郭慧琛，曹隨忠，孫世琪*，姚學(xué)萍 *

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730046)

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文獻(xiàn)綜述

犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒研究進(jìn)展

王斌1,2，徐綺嬪2，郭慧琛2，曹隨忠1，孫世琪2*，姚學(xué)萍1 *

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730046)

摘要：犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒(VLPs)是利用表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)犬細(xì)小病毒衣殼蛋白VP2后，自我組裝而成，與天然病毒具有相似的形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)，其不含有病毒的遺傳物質(zhì)，且具有較好的安全性和免疫原性，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中于研發(fā)病毒樣顆粒疫苗，而應(yīng)用病毒樣顆粒作為生物載體亦是目前的關(guān)注熱點(diǎn)。此外，近年來利用不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2蛋白后組裝獲得病毒樣顆粒的報道層出不窮?；诖耍撐木C述了犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的獲得及其應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為相關(guān)科研工作者提供參考。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；病毒樣顆粒；體外組裝；生物應(yīng)用;疫苗

犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是利用特定表達(dá)質(zhì)粒將編碼犬細(xì)小病毒衣殼蛋白的基因轉(zhuǎn)入原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，組裝獲得的高度結(jié)構(gòu)化的空心顆粒。CPV VLPs形態(tài)和結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子相似，通過與病毒感染宿主細(xì)胞相似的途徑遞呈給免疫細(xì)胞(T、B淋巴細(xì)胞)，進(jìn)而有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[1]。CPV VLPs因不含病毒的遺傳物質(zhì)無法增殖且無致病性，對犬細(xì)小病毒病來說是一種最為理想的高效疫苗形式。它還可以作為生物載體通過化學(xué)偶聯(lián)或者通過衣殼蛋白內(nèi)部電性作用攜帶非蛋白抗原[2]。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者針對30多種感染人和動物的不同病毒已經(jīng)研究出相應(yīng)的VLPs，其中幾種VLPs疫苗已商品化應(yīng)用于市場[3]。對于犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的研究目前仍停留在衣殼蛋白的構(gòu)建和表達(dá)鑒定等方面，商品化的CPV VLPs疫苗還尚未見報道。

1CPV VLPs的生物學(xué)特性

犬細(xì)小病毒可引起犬急性出血性腸炎和急性心肌炎，發(fā)病率和病死率高，對犬及狐等經(jīng)濟(jì)動物具有極大的危害。CPV是一類結(jié)構(gòu)簡單的線狀單鏈DNA病毒，形態(tài)呈六角形或圓形，等軸對稱的20面體，直徑約為20 nm，衣殼蛋白無囊膜，不含脂質(zhì)或糖類。CPV衣殼蛋白只含有VP1和VP2兩種蛋白，其中VP2占90%，而VP1只占10%[4-5]。成熟的病毒粒子還含有VP2的裂解產(chǎn)物VP3蛋白，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)[6]。VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，全長1755 bp, 編碼584個氨基酸，位于VP1的C端，其上的幾個關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化將會改變病毒抗原特性和宿主范圍[7]。VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重疊，且二者終止于同一密碼子[8]。VP2是CPV的主要保護(hù)性抗原蛋白，是制備CPV基因工程疫苗的重要侯選保護(hù)性抗原[9]。利用CPV VP2蛋白獲得的病毒樣顆粒，不僅保持了CPV的免疫原性，還能夠模擬CPV自然病毒粒子感染途徑，通過VP2蛋白與細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)CPV VLPs的靶向定位或載運(yùn)[10-12]。

2CPV病毒樣顆粒的獲得

CPV VLPs的制備通常是由表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)衣殼蛋白VP2后體外組裝而獲得。一般常用的表達(dá)系統(tǒng)分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，而原核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用較多的是大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)[2]?，F(xiàn)今使用較成熟的CPV VLPs表達(dá)系統(tǒng)主要以真核表達(dá)系統(tǒng)為優(yōu)先選擇，主要原因是真核表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白翻譯后的修飾和折疊，表達(dá)的重組VP2蛋白具有天然的分子構(gòu)象，利于VLPs的形成[13-14]。

2.1真核表達(dá)系統(tǒng)獲得CPV VLPs

2.1.1酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有研究者采用PCR方法對CPV VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，將CPV VP2基因克隆到畢赤酵母分泌的載體pPICZAA中，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZAA-VP2，然后將該重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母X-33中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)CPV VP2蛋白。經(jīng)Western blot鑒定表明，重組質(zhì)粒pPICZAA-VP2表達(dá)的蛋白能夠被CPV VP2單克隆抗體識別，為CPV VP2蛋白。擴(kuò)大表達(dá)后選擇鎳親和層析柱分離、純化帶組氨酸標(biāo)簽的CPV VP2蛋白。血凝試驗(yàn)表明,純化后的CPV VP2蛋白具有血凝性。蛋白酶切除標(biāo)簽，使用弗氏不完全佐劑乳化后接種小鼠，血凝抑制試驗(yàn)表明,純化后的CPV VP2蛋白能夠刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)[15]。但該試驗(yàn)未進(jìn)行深入研究，重組畢赤酵母菌所表達(dá)的CPV VP2蛋白在體外是否能夠自組裝成VLPs,刺激有機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的是病毒樣顆粒還是VP2蛋白等有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.1.2昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要是利用桿狀病毒作為載體，使衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。有研究者成功構(gòu)建了表達(dá)CPV VP2蛋白的重組桿狀病毒Bac-VP2表達(dá)載體。該病毒感染昆蟲細(xì)胞或家蠶后，能夠大量表達(dá)CPV VP2蛋白，電鏡檢測時觀察到直徑25 nm的球形VLPs，表明該系統(tǒng)大量表達(dá)的CPV VP2蛋白能夠自組裝成VLPs，且大小、形態(tài)與天然病毒粒子相似。隨后用蠶蛹表達(dá)的CPV VLPs分別通過肌肉注射和口服兩種方式免疫接種豚鼠，兩種免疫途徑豚鼠血清均產(chǎn)生了血凝抑制抗體[16]。Choudary P V等[17]利用蠶蛹幼蟲成功表達(dá)了CPV VLPs，接種小鼠后證實(shí)該病毒樣顆粒具有較強(qiáng)免疫原性。

此外，狂犬病病毒、犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒嵌合體病毒樣顆粒在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)，使用該嵌合體病毒樣顆粒免疫接種小鼠，經(jīng)電子顯微鏡觀察、血凝抑制試驗(yàn)及間接免疫熒光檢測，結(jié)果表明，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功獲得的犬細(xì)小病毒嵌合體病毒樣顆粒具有高免疫原性[18]。

桿狀病毒載體具有宿主范圍窄、不感染人類、滅活簡單等優(yōu)點(diǎn)，同時桿狀病毒基因組能夠容納大量外源基因，可同時表達(dá)多種衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。更重要的是，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以對表達(dá)后的病毒結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行修飾，如衣殼蛋白糖基化等，從而促進(jìn)了VLPs的正確組裝；使用蔗糖密度梯度離心法純化昆蟲細(xì)胞表達(dá)的VLPs，因其不含有哺乳動物病原體組分，安全性好，該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于商品化VLPs疫苗的研制中。但是，利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)組裝的CPV VLPs因其使用的載體質(zhì)粒含有桿狀病毒基因，純化所得蛋白內(nèi)容易受到桿狀病毒污染，使其應(yīng)用受到限制。

2.1.3其他真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在過去幾十年里，以植物表達(dá)系統(tǒng)為生產(chǎn)平臺的應(yīng)用體系，因快速、高擴(kuò)展性和高性價比等優(yōu)點(diǎn)成為工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)所關(guān)注的熱點(diǎn)。此外，植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后的修飾也類似于哺乳動物細(xì)胞。在植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，既能通過穩(wěn)定引進(jìn)轉(zhuǎn)基因成核或質(zhì)體基因組，又能以植物病毒載體瞬時轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)重組蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá)[19-20]。

在植物細(xì)胞表達(dá)VLPs的研究領(lǐng)域中，進(jìn)展居前的是諾瓦克病毒(Norwalk virus，NV)VLPs疫苗[21]。除此之外，利用植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)已成功表達(dá)的VLPs還有艾滋病Gag蛋白疫苗、二價乙型肝炎疫苗、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗、嵌合體AIMV疫苗等。這些VLPs在靈長類動物體內(nèi)均產(chǎn)生了強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[22]。目前未見利用上述表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CPV VLPs的報道，其開發(fā)應(yīng)用潛力有待進(jìn)一步研究。

采用哺乳動物或禽類細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的VLPs能夠?qū)Ψg后的蛋白復(fù)合物進(jìn)行糖基化修飾，其性狀和病毒自身的蛋白相似，同時又具有較好的免疫原性，然而生產(chǎn)過程的高成本和潛在的安全問題仍是一個制約性的挑戰(zhàn)。

2.2原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得CPV VLPs

與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是目前公認(rèn)的高效、廉價、安全性良好的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)CPV VLPs的研究已取得初步進(jìn)展。Xu J等[23]利用PCR成功擴(kuò)增CPV VP2基因，將VP2基因克隆于pSMK載體中，從而獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pSMK-VP2，所構(gòu)建的質(zhì)粒還在VP2的N端融合表達(dá)His標(biāo)簽與SUMO標(biāo)簽。將該重組質(zhì)粒pSMK-VP2轉(zhuǎn)化入BL21宿主菌(E.coliBL21-codon Plus (DE3)-RIL)中16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)；His標(biāo)簽用于鎳親和層析柱分離、純化CPV VP2蛋白。純化的CPV VP2蛋白和SUMO蛋白酶按一定比例混合切除上述兩種標(biāo)簽后，利用VP2結(jié)構(gòu)蛋白自組裝的特性，使其在體外環(huán)境下形成CPV VLPs。經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)鑒定表明，體外環(huán)境自組裝成的CPV VLPs具有與天然病毒相似的顆粒狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)接種小鼠后淋巴細(xì)胞分類檢測結(jié)果顯示，該表達(dá)系統(tǒng)自組裝成的CPV VLPs具有免疫原性，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。這是CPV VLPs在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)的一個實(shí)例。另有部分學(xué)者以相似的研究思路，利用原核載體表達(dá)了VP2蛋白，體外酶切切除氨基酸標(biāo)簽后借助VP2自組裝特性形成CPV VLPs[24]。由大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后自組裝產(chǎn)物CPV VLPs蛋白量較少、純度較低，其他相關(guān)研究中只是涉及到利用大腸埃希菌系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白，小鼠接種后探討純化VP2蛋白的免疫原性以及結(jié)合CPV抗體的特異性。而對該VP2蛋白能否形成VLPs未做深入研究[25-27]。

綜上所述，對于CPV VLPs的表達(dá)多數(shù)集中于昆蟲表達(dá)系統(tǒng)利用桿狀病毒表達(dá)了CPV VP2蛋白VLPs和在原核表達(dá)系統(tǒng)使用大腸埃希菌表達(dá)特異性CPV VLPs。預(yù)防病毒性疾病CPV VLPs亞單位疫苗被證明具有潛在的應(yīng)用前景，但對于CPV VLPs表達(dá)體系的選擇和優(yōu)化還需深入的研究。

3CPV VLPs的生物學(xué)應(yīng)用

3.1CPV VLPs在病毒學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

CPV VLPs的獲得主要是將CPV的VP2衣殼蛋白在相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)后自組裝成VLPs，與天然病毒具有類似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此，在進(jìn)行CPV入侵及出芽等方面的研究時，可以利用自組裝的CPV VLPs模擬真實(shí)病毒感染途徑用于研究CPV入侵細(xì)胞的方式及其在機(jī)體細(xì)胞中的定位。利用帶有特殊熒光標(biāo)記的CPV VLPs對感染動物機(jī)體進(jìn)行組織細(xì)胞熒光定位，研究天然病毒對動物體的感染途徑。Feng H等[13]分析了通過昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CPV VP2蛋白在形成VLPs時的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及在體外環(huán)境下VLPs的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，CPV VP1蛋白的缺失并不影響VLPs的形成，在一定情況下，單獨(dú)表達(dá)VP2蛋白可以自組裝成CPV VLPs，且形態(tài)上類似天然病毒[28-30]。

3.2CPV VLPs在疫苗研究中的應(yīng)用

目前，VLPs已經(jīng)發(fā)展成為一種比較成熟的疫苗平臺，有著廣泛的應(yīng)用。由病毒的囊膜或者衣殼蛋白組成的VLPs，經(jīng)鼻內(nèi)或皮膚注射給藥，能夠刺激實(shí)驗(yàn)小鼠、非靈長類或者人產(chǎn)生針對多種病原的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，作為在疫苗免疫的應(yīng)用上具有良好的潛質(zhì)[31]。

CPV VLPs空間結(jié)構(gòu)與天然病毒更加接近且不含病毒遺傳物質(zhì)，具有比包涵體重組蛋白更強(qiáng)的免疫原性，比活毒疫苗、減毒疫苗和病毒載體疫苗更安全的優(yōu)點(diǎn)。因此，基于VLPs平臺開發(fā)預(yù)防性和治療性疫苗無疑是最有效的疫苗策略之一。VLPs作為一種新型亞單位疫苗，無論是單一VLPs疫苗還是嵌合體VLPs疫苗，VLPs都可以作為直接免疫原，刺激機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前臨床應(yīng)用上約有20種～30種VLPs，但應(yīng)用較為成熟的只有2種VLPs，分別是利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的人源乙型肝炎病毒VLPs疫苗和人乳頭瘤病毒VLPs疫苗?，F(xiàn)階段，CPV VLPs疫苗的研發(fā)也只是停留在對實(shí)驗(yàn)動物小鼠免疫評價階段，病毒原屬動物免疫學(xué)評價還未見有報道。

3.3CPV VLPs作為生物載體的應(yīng)用

通常情況下，病毒結(jié)構(gòu)蛋白上大多存在帶正電荷的堿性多肽域，并且這些堿性多肽域一般位于顆粒內(nèi)部，所以可以與帶負(fù)電荷的核酸磷酸骨架形成一種非特異性、高親和性的相互作用力。類似地，其他帶有合適電荷的物質(zhì)，都可以被包裹入VLPs球心內(nèi)部或化學(xué)偶聯(lián)于其表面，因此VLPs可作為基因或藥物轉(zhuǎn)移的載體[32-33]。使用VLPs免疫，可以將VLPs作為分子載體在VLPs表面構(gòu)建多個抗原決定基因，增加其免疫原性的同時，擴(kuò)大VLPs的免疫效果。

Han J E等[34-35]利用猿猴病毒SV40病毒樣顆粒在體外自組裝時將量子點(diǎn)包被其中，通過光譜特性分析發(fā)現(xiàn)，SV40病毒樣顆粒嵌合體(VLP-QD)具有良好的穩(wěn)定性。在活細(xì)胞刺激培養(yǎng)時， SVLP-QD是以胞膜內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，沿微管積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；此方式類似天然病毒感染細(xì)胞的途徑。利用病毒樣顆粒包被具有熒光特性的量子點(diǎn)或磁性納米粒子，在動物體內(nèi)作為檢測病毒的熒光標(biāo)記物或粒子靶向給藥的載體，在一個直接可見的方式下研究病原體對宿主的致病性機(jī)制。此外，SVLP-QD可進(jìn)一步發(fā)展為多功能納米粒子用于體內(nèi)腫瘤的診斷、定位、檢測治療等類似應(yīng)用。

4CPV VLPs應(yīng)用前景展望

CPV VLPs是由病毒VP2蛋白自組裝成的空心顆粒，因其不含病毒的遺傳物質(zhì)，無法復(fù)制和增殖，而不具備感染致病的能力，安全性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的滅活疫苗和活病毒疫苗[2]。利用不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CPV VLPs具有接近天然病毒粒子的空間構(gòu)象和抗原表位展示，在通常情況下能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效、持久的全身性免疫反應(yīng)，有望成為一種新型的CPV疫苗[1]。但是，CPV VLPs的生產(chǎn)尚存在一些技術(shù)難題，例如各種表達(dá)系統(tǒng)下生產(chǎn)出的VLPs流程較復(fù)雜，最后得率較低，阻礙了VLPs從實(shí)驗(yàn)室到臨床上的轉(zhuǎn)化。在CPV VLPs形成過程中，其實(shí)就是衣殼蛋白聚集和自組裝之間相互競爭的過程。溫度、離子強(qiáng)度、pH都容易影響VLPs的自組裝，組裝過程中小部分蛋白聚集就能嚴(yán)重影響VLPs的產(chǎn)量和均一性。影響VLPs疫苗發(fā)揮作用的主要因素在于它能夠很好的保持三維構(gòu)象，從而具有與天然病毒十分相似的抗原表位。VLPs形成過程對外界環(huán)境比較敏感，外部環(huán)境變化較大，就會影響VLPs疫苗的效價。這就需要探尋不同表達(dá)系統(tǒng)下CPV VLPs組裝過程中主要的影響因素，最大可能地減少聚集的發(fā)生。

已有研究表明,不同表達(dá)系統(tǒng)下獲得的CPV VLPs在免疫動物后取得了較好的免疫效果，雖然目前疾病預(yù)防還主要依靠滅活苗和弱毒苗，但是病毒樣顆粒疫苗以它獨(dú)具的優(yōu)勢，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但對于CPV VLPs表達(dá)體系的選擇和優(yōu)化以及佐劑的劑量仍需深入研究。此外，利用CPV VLPs生物載體的特性，通過化學(xué)偶聯(lián)或者生物蛋白包被的方式結(jié)合不同形式的載運(yùn)體，包括抗性基因、抗癌藥物、納米顆粒、熒光量子點(diǎn)等，期望能夠在研究生物靶向藥物治療和生物成像方面為CPV VLPs更廣泛的生物應(yīng)用擴(kuò)展思路。

參考文獻(xiàn):

[1]Kushnir N,Streatfield S J,Yusibov V.Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform: diversity of targets and production systems and advances in clinical development[J].Vaccine,2012,31(1):58-83.

[2]Zhu Y,Huang Y,Wang Y,et al.Genome sequence of a canine parvovirus strain,CPV-s5,prevalent in Southern China[J].Genome Announc,2014,2(1):272-273.

[3]Jennings G T,Bachmann M F.The coming of age of virus-like particle vaccines[J].Biol Chem,2008,389(5):521-536.

[4]Zhong Z,Liang L,Zhao J,et al.First isolation of new canine parvovirus 2a from Tibetan mastiff and global analysis of the full-length VP2 gene of canine parvoviruses 2 in China[J].Int J Mol Sci,2014,15(7):12166-12187.

[5]Mochizuki M,Ohshima T,Une Y,et al.Recombination between vaccine and field strains of canine parvovirus is revealed by isolation of virus in canine and feline cell cultures[J].J Vet Med Sci,2008,70(12):1305-1314.

[6]Mohan R J,Mukhopadhyay H K,Thanislass J,et al.Isolation,molecular characterization and phylogenetic analysis of canine parvovirus[J].Infect Genet Evol,2010,10(8):1237-1241.

[7]李世靜，嵇辛勤，主性，等.犬細(xì)小病毒VP2基因測序分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(6):96-100.

[8]Sun Y L,Yen C H,Tu C F.Visual detection of canine parvovirus based on loop-mediated isothermal amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay and with lateral flow dipstick[J].J Vet Med Sci,2014,76(4):509-516.

[9]Stucker K M,Pagan I,Cifuente J O,et al.The role of evolutionary intermediates in the host adaptation of canine parvovirus[J].J Virol,2012,86(3):1514-1521.

[10]Litster A,Nichols J,Volpe A.Prevalence of positive antibody test results for canine parvovirus (CPV) and canine distemper virus (CDV) and response to modified live vaccination against CPV and CDV in dogs entering animal shelters[J].Vet Microbiol,2012,157(1-2):86-90.

[11]Dahiya S S,Saini M,Kumar P,et al.Immunogenicity of a DNA-launched replicon-based canine parvovirus DNA vaccine expressing VP2 antigen in dogs[J]. Res Vet Sci,2012,93(2):1089-1097.

[12]Bolhassani A,Safaiyan S,Rafati S.Improvement of different vaccine delivery systems for cancer therapy[J].Mol Cancer,2011,10:3.doi: 10.1186/1476-4598-10-3.

[13]Feng H,Liang M,Wang H L,et al.Recombinant canine parvovirus-like particles express foreign epitopes in silkworm pupae[J].Vet Microbiol,2011,154(1-2): 49-57.

[14]Sominskaya I,Skrastina D,Dislers A,et al.Construction and immunological evaluation of multivalent hepatitis B virus (HBV) core virus-like particles carrying HBV and HCV epitopes[J].Clin Vac Immunol,2010,17(6):1027-1033.

[15]Shang W,Liu J,Yang J,et al.Dengue virus-like particles: construction and application[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,94(1):39-46.

[16]Mortola E,Roy P.Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system[J].FEBS Lett,2004,576(1-2):174-178.

[17]Choudary P V,Kamita S G,Maeda S.Expression of foreign genes in Bombyx mori larvae using baculovirus vectors[J].Meth Mol Biol,1995,39:243-264.

[18]Feng H,Hu G Q,Wang H L,et al.Canine parvovirus VP2 protein expressed in silkworm pupae self-assembles into virus-like particles with high immunogenicity[J].PLoS One,2014,9(1):e79575.

[19]Sojikul P,Buehner N,Mason H S.A plant signal peptide-hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(5):2209-2214.

[20]Meyers A,Chakauya E,Shephard E,et al.Expression of HIV-1 antigens in plants as potential subunit vaccines[J].BMC Biotechnol,2008,8:53.

[21]Lai H,Chen Q.Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current good manufacture practice regulations[J].Plant Cell Rep,2012,31(3):573-584.

[22]Scotti N,Alagna F,Ferraiolo E,et al.High-level expression of the HIV-1 Pr55gag polyprotein in transgenic tobacco chloroplasts[J].Planta,2009,229(5):1109-1122.

[23]Xu J,Guo H C,Wei Y Q,et al.Self-assembly of virus-like particles of canine parvovirus capsid protein expressed fromEscherichiacoliand application as virus-like particle vaccine[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(8):3529-3538.

[24]Roldao A,Mellado M C,Lima J C,et al.On the effect of thermodynamic equilibrium on the assembly efficiency of complex multi-layered virus-like particles (VLP): the case of rotavirus VLP[J]. PLoS Comput Biol,2012,8(2):e1002367.

[25]Greiner V J,Manin C,Larquet E,et al.Characterization of the structural modifications accompanying the loss of HBsAg particle immunogenicity[J].Vaccine,2014,32(9):1049-1054.

[26]Visciano M L,Tagliamonte M,Tornesello M L,et al.Effects of adjuvants on IgG subclasses elicited by virus-like particles[J].J Transl Med,2012,10(4):1-8.

[27]Kaba S A,Mccoy M E,Doll T A,et al.Protective antibody and CD8+T-cell responses to thePlasmodiumfalciparumcircumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine[J].PLoS One,2012,7(10):e48304.

[28]Goldinger S M,Dummer R,Baumgaertner P,et al.Nano-particle vaccination combined with TLR-7 and -9 ligands triggers memory and effector CD8(+) T-cell responses in melanoma patients[J].Eur J Immunol,2012,42(11):3049-3061.

[29]Derdak S V,Kueng H J,Leb V M,et al.Direct stimulation of T lymphocytes by immunosomes: virus-like particles decorated with T cell receptor/CD3 ligands plus costimulatory molecules[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(35):13144-13149.

[30]Giannini S L,Hanon E,Moris P,et al.Enhanced humoral and memory B cellular immunity using HPV16/18 L1 VLP vaccine formulated with the MPL/aluminium salt combination (AS04) compared to aluminium salt only[J].Vaccine,2006,24(33-34):5937-5949.

[31]Tong T,Crooks E T,Osawa K,et al.Multi-parameter exploration of HIV-1 virus-like particles as neutralizing antibody immunogens in guinea pigs,rabbits and macaques[J].Virology,2014,3(15):55-69.

[32]Szwed M,Matusiak A,Laroche-Clary A,et al.Transferrin as a drug carrier: Cytotoxicity, cellular uptake and transport kinetics of doxorubicin transferrin conjugate in the human leukemia cells[J].ToxicolInVitro,2014,28(2):187-197.

[33]Drbohlavova J,Chomoucka J,Adam V,et al.Nanocarriers for anticancer drugs-new trends in nanomedicine[J].Curr Drug Metab,2013,14(5):547-564.

[34]Han J E,Kim H K,Park S A,et al.A nontoxic derivative of lipopolysaccharide increases immune responses to Gardasil HPV vaccine in mice[J].Int Immunopharmacol,2010,10(2):169-176.

[35]Ding Y,Chuan Y P,He L,et al.Modeling the competition between aggregation and self-assembly during virus-like particle processing[J].Biotechnol Bioeng，2010,107(3):550-560.

Progress on Virus-like Particles of Canine Parvovirus

WANG Bin1,2, XU Qi-pin2,GUO Hui-chen2,CAO Sui-zhong1,SUN Shi-qi2,YAO Xue-ping1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Chengdu,Sichuan,611130,China;2.KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Lanzhou,Gansu,730046,China)

Abstract:The virus-like particles(VLP) of canine parvovirus are self-assembled by capsid protein VP2 of canine parvovirus(CPV).It possesses the similar morphology and spatial structure with the natural virus.CPV VLPs do not contain any genetic materials of CPV ensuring that they get better immunogenicity and safety.It could simulate the body to generate immunoreaction well.In recent years,there have been lots of reports that the CPV VP2 has been used to construct VLPs by self-assembly.The applications of CPV VLPs now mainly focus on the vaccine research.This review summarized the production of the CPV VLPs and their applications expecting to provide references for researchers.

Key words:Canine parvovirus(CPV);virus-like particles; in-vitro Assembly;biological application;vaccine

文章編號:1007-5038(2016)03-0081-05

中圖分類號:S852.659.2;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：王斌(1989-)，男，寧夏石嘴山人，碩士研究生,主要從事犬細(xì)小病毒樣顆粒的研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國家國際科技合作專項(xiàng)( 2014DFA31890)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2013BAD12B00)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A211)；甘肅省國際科技合作項(xiàng)目(1104WCGA185)

收稿日期：2015-08-29