李晶 劉玉蘭

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第細(xì)胞水平的肝臟纖維化力學(xué)研究

李晶 劉玉蘭

疾病情況下肝臟的物理特性與患者的照護(hù)和處置方式有著密切的聯(lián)系。通?？赏ㄟ^觸診來評價(jià)肝臟的硬度(肝臟纖維化程度的代表指標(biāo))，這也是我們教會(huì)醫(yī)學(xué)生評估肝臟情況體格檢查的重要一課。臨床實(shí)踐中有很多用于評估肝臟硬度的影像學(xué)手段，眾多研究也表明，肝臟的硬度和臨床表現(xiàn)有明確的相關(guān)性，肝臟越硬，肝臟發(fā)生硬化和肝細(xì)胞功能異常以及肝細(xì)胞癌的可能性就越大[1-2]。盡管在臨床上已經(jīng)有這樣的認(rèn)識，在基礎(chǔ)研究層面，肝臟硬度和其病理學(xué)之間的聯(lián)系尚無系統(tǒng)的探討。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝臟基質(zhì)增加時(shí)可以激活肝臟的星狀細(xì)胞(HSC)分化，但對于肝臟基質(zhì)硬度增加與肝細(xì)胞功能障礙之間的關(guān)系知之甚少。Desai等[3]的研究明確提示，基質(zhì)的硬度而非其濃度、結(jié)構(gòu)或成分造成肝細(xì)胞的去分化從而影響了其生理功能。更重要的是，這項(xiàng)研究同時(shí)也填補(bǔ)了目前關(guān)于肝臟硬度如何影響肝細(xì)胞功能這一知識領(lǐng)域的空白，即肝臟硬度的增加可以直接減少肝核因子4α(HNF4α)這一在肝臟細(xì)胞分化過程中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這項(xiàng)研究有著非常重要的臨床意義：即肝臟硬度的增加的過程中發(fā)生了肝細(xì)胞的去分化，這在一定程度上揭示了肝硬化時(shí)肝功能異常及腫瘤形成的潛在機(jī)制。此外，粘著斑激酶(FAK)和Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路參與了此過程，提示針對FAK和ROCK的抑制劑有可能改善纖維化狀態(tài)的肝臟功能。

Desai等的研究也有助于我們理解肝臟的物理特性。通過影像學(xué)檢查以及針對移植物和體外動(dòng)物肝臟的研究，總結(jié)了“大體”肝臟的物理特點(diǎn)——肝臟硬度是上述所有組織總和的硬度[4]，而Desai等在小鼠的肝臟中進(jìn)行了微米級別的精細(xì)研究。使用原子力顯微鏡(AFM)詳細(xì)描繪了正常和纖維化小鼠肝臟中央靜脈、匯管區(qū)、兩區(qū)之間水平和垂直的纖維間隔等的力學(xué)特點(diǎn)。這種研究手段既往已用于證實(shí)小鼠肺纖維化硬度大于正常肺，而且通常表現(xiàn)為局部硬度顯著增加。

Desai等發(fā)現(xiàn)，正常的肝臟在力學(xué)上呈現(xiàn)異質(zhì)性的特點(diǎn)，肝臟實(shí)質(zhì)異質(zhì)性與其解剖學(xué)的相關(guān)性目前尚不清楚，其力學(xué)特性在一定程度上反應(yīng)了肝細(xì)胞索、Disse間隙和單層內(nèi)皮細(xì)胞等存在硬度的差別。與預(yù)想一致的是，門脈區(qū)比中央靜脈區(qū)硬度高。這些硬度差異很輕微且并沒有達(dá)到明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Desai等的研究提示，即使是非常輕微的硬度差別，也有可能對肝細(xì)胞等細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能產(chǎn)生巨大影響。細(xì)胞本身是問題的關(guān)鍵。本研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞對環(huán)境硬度變化的壓力感受，并強(qiáng)調(diào)了肝臟不同區(qū)域的肝細(xì)胞暴露在具有不同力學(xué)特性的基質(zhì)微環(huán)境中。對于基質(zhì)力學(xué)特點(diǎn)的異質(zhì)性如何影響正常生理情況下肝細(xì)胞的生物學(xué)行為目前尚有待于進(jìn)一步的研究，肝臟不同分區(qū)中基質(zhì)力學(xué)的差別可以部分解釋不同分區(qū)中肝細(xì)胞功能、可溶物的表達(dá)以及對損傷易感性的差別。本研究指出，在理解肝細(xì)胞功能分區(qū)時(shí)應(yīng)將肝臟不同分區(qū)的基質(zhì)力學(xué)特性納入考慮之中。

當(dāng)發(fā)生了肝臟纖維化之后，不同分區(qū)的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞環(huán)境的力學(xué)異質(zhì)性更加突出[3]。本研究使用AFM和高分辨率光學(xué)顯微鏡觀察了發(fā)生了纖維化的肝臟硬化局部的特殊結(jié)構(gòu)。引起研究者興趣的問題是：竇周毛細(xì)血管化，代表了早期纖維化過程，是否可以影響局部力學(xué)特性并通過力學(xué)特性的改變影響局部肝細(xì)胞和新生基底膜上血竇內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

發(fā)生膽管纖維化時(shí)，肝臟整體的硬度增加最為明顯。與這一觀點(diǎn)類似，通過AFM手段研究發(fā)現(xiàn)，盡管兩種動(dòng)物模型的肝臟間質(zhì)中均有纖維間隔形成，3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)誘導(dǎo)的伴有膽管損傷的小鼠肝硬化模型的肝臟硬度是CCl4模型的兩倍。除了早期纖維化階段外，上述模型對肝細(xì)胞的影響并不大，這兩種動(dòng)物模型肝臟中幾乎纖維瘢痕形成的全部區(qū)域內(nèi)壓力均超過了1 kPa，這種肝細(xì)胞所處環(huán)境的硬度的改變對肝細(xì)胞功能的影響趨于平穩(wěn)狀態(tài)。而肝星狀細(xì)胞，至少在培養(yǎng)環(huán)境下，對環(huán)境硬度感受比肝細(xì)胞更敏感，可發(fā)生纖維化、凋亡等，這也意味著不同區(qū)域的HSC表達(dá)了不同的蛋白酶。這對于纖維化的逆轉(zhuǎn)有重要的意義，也解釋了為什么會(huì)出現(xiàn)部分纖維間隔周圍細(xì)胞缺失，相對于其他非膽管瘢痕結(jié)構(gòu)而言，膽管瘢痕硬度更高、更難降解。是否在纖維化進(jìn)程中存在纖維間隔力學(xué)層面的“不可逆點(diǎn)”？這個(gè)問題的答案將對于我們在將來定義人類肝硬化的特定“硬度”具有重大意義并有助于我們理解肌成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生蛋白酶和最易誘導(dǎo)凋亡的硬度范圍。部分學(xué)者認(rèn)為，纖維化進(jìn)程中膠原的含量變化不大，但膠原的組分發(fā)生變化使其更加分散，大的纖維變?yōu)樾∑尾⒉迦敫渭?xì)胞之間[5]。這一過程中局部的力學(xué)改變是怎樣的？肝細(xì)胞在此過程中又將發(fā)生怎樣的反應(yīng)？

Desai等使用AFM對上述問題的解答有部分提示。首先他們的工作為肝臟不同狀態(tài)下精確的力學(xué)特性提供了大量的信息。在小鼠模型中描繪了終末期硬化時(shí)、病毒性、膽源性以及脂肪性等不同基質(zhì)組分狀態(tài)下肝臟不同分區(qū)的硬度特點(diǎn)，這為我們理解纖維化如何形成、肝細(xì)胞功能異常以及潛在的可逆過程提供了關(guān)鍵信息。他們的工作也為我們理解硬化基礎(chǔ)上肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生提供了部分線索。若與Desai等觀察到的一致，即在肝臟基質(zhì)硬度增加時(shí)肝細(xì)胞的增殖增加，則提示在肝臟中存在特定的硬度區(qū)域或特殊的力學(xué)/結(jié)構(gòu)區(qū)域，這將為HCC的形成提供一個(gè)合適的微環(huán)境或一次亦或二次打擊。最后，通過分析不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的高分辨硬度變化將有可能揭示肝臟早期修復(fù)的力學(xué)變化，同時(shí)也可能幫助我們理解肝臟結(jié)構(gòu)例如橋接纖維化形成中的力學(xué)變化。Desai等這項(xiàng)研究在回答了許多科學(xué)問題的同時(shí)也揭開了肝臟的力學(xué)特性這一新的研究領(lǐng)域的全新篇章。

[1] Tatsumi A, Maekawa S, Sato M, et al. Liver stiffness measurement for risk assessment of hepatocellular carcinoma. Hepatol Res, 2015,45:523-532.

[2] Singh S, Fujii LL, Murad MH, et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation,liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: a systematic review and meta-analysis. Clin Gastroenterol Hepatol, 2013,11:1573-1584.e1-2; quiz, e88-89.

[3] Desai SS, Tung JC, Zhou VX, et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology,2016,64:261-275.

[4] Perepelyuk M, Chin L, Cao X, et al. Normal and fibrotic rat livers demonstrate shear strain softening and compression stiffening: a model for soft tissue mechanics. PLoS One,2016,11:e0146588.

[5] Popov Y, Sverdlov DY, Sharma AK, et al. Tissue transglutaminase does not affect fibrotic matrix stability or regression of liver fibrosis in mice. Gastroenterology， 2011,140:1642-1652.

(本文編輯：張苗)

100000 北京大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

2016-09-24)