李帥 張建忠 栗玉珍

角蛋白16在皮膚屏障功能中的作用

李帥 張建忠 栗玉珍

角蛋白16是表皮角質(zhì)形成細胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在維持細胞功能及皮膚屏障功能方面起著重要作用。角蛋白16的表達不僅高度依賴角質(zhì)形成細胞狀態(tài)和分化程度，在不同類型的上皮細胞內(nèi)表達程度也不同，當(dāng)角蛋白16的表達異常時，病變部位的皮膚屏障功能會受到不同程度的破壞，未受累皮膚的屏障功能也會受到影響，不僅皮膚滲透屏障功能受到影響，還會引起皮膚炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機體受到進一步損害。

角蛋白16；角蛋白細胞；滲透；免疫；屏障

1 角蛋白16的結(jié)構(gòu)、功能、基因表達

1.1 結(jié)構(gòu)：角蛋白是中間絲蛋白家族的一員，相對分子質(zhì)量為40 000～70 000。根據(jù)角蛋白氨基酸序列、電荷及免疫特性將角蛋白分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型角蛋白多為酸性角蛋白，相對分子質(zhì)量為40 000～64 000，PI為 4.7 ～ 6.1。Ⅱ型角蛋白多為中性或堿性角蛋白，相對分子質(zhì)量52 000～68 000，PI為5.4～8.4（角蛋白 16、10）。角蛋白 16 與其他角蛋白一樣成對出現(xiàn)。但不像其他角蛋白纖維由Ⅰ型、Ⅱ型以1∶1比例聚合成異源二聚體，而是通過角蛋白纖維延伸、聚合形成同源二聚體，在角質(zhì)形成細胞中發(fā)揮作用［1］。

1.2 功能：角蛋白由多基因家族編碼，是脊椎動物上皮細胞主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在細胞質(zhì)中形成復(fù)雜的10 nm細胞纖維網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，維持細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能［2］，并以精細、獨特方式調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的最終分化。離體實驗發(fā)現(xiàn)，角蛋白16形成的二聚體與其反平行的二聚體形成穩(wěn)定四聚體。這些高效四聚體在細胞質(zhì)中形成，確保這些角蛋白纖維在細胞核周圍聚合成10 nm細胞纖維網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，發(fā)揮其特定作用。已有證據(jù)支持四聚體形成是角蛋白亞基形成聚合物池的必要途徑。體外研究表明，角蛋白16具有獨特的性能，可以驅(qū)動蛋白影響組織結(jié)構(gòu)［3］?？傊?，角蛋白16的調(diào)節(jié)，取決于上皮組織類型及其終末分化，其表達異常會對皮膚產(chǎn)生不良影響。

1.3 基因表達：角蛋白基因位點集簇于染色體的兩個區(qū)域，大部分Ⅰ型角蛋白基因位于染色體17q21，Ⅱ型角蛋白基因位于染色體12q13。兩型角蛋白基因結(jié)構(gòu)相似，但不同的角蛋白基因核酸序列大不相同，因此角蛋白的功能各不相同。

表皮生長因子（EGF）對角蛋白16基因表達起重要作用。研究表明，EGF介導(dǎo)角蛋白16基因表達主要是通過有絲分裂原激活的蛋白激酶介導(dǎo)的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。c-Jun的COOH端和p300在EGF誘導(dǎo)角蛋白16表達也起了舉足輕重的作用［4］。另外 EGF對角蛋白16基因表達可以被病毒蛋白E1A阻礙。

通過誘導(dǎo)角蛋白16啟動子Sp1結(jié)合位點（127to 122 bp）和AP1結(jié)合位點（148 to 142 bp）點突變能夠明顯抑制由EGF介導(dǎo)的角蛋白16啟動子的活性。由此可以看出，位于啟動子位點的Sp1和AP1在EGF介導(dǎo)的角蛋白16表達過程中起重要作用。總之，在銀屑病、特應(yīng)性皮炎（AD）和腫瘤等皮膚屏障功能受損的病變中，Sp1、AP1、c-Jun、共同激活因子p300/CBP在調(diào)控EGF介導(dǎo)的角蛋白16基因表達起重要作用。

作者單位：150086哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科

2 角蛋白16在皮膚屏障功能中的作用

皮膚屏障功能主要包括滲透屏障功能和免疫屏障功能。表皮屏障功能的維持不僅依賴于角蛋白與脂類共價連接，還依賴于細胞間的緊密連接蛋白及相關(guān)蛋白緊密連接。此外，橋粒芯蛋白1與角膜鎖鏈蛋白交叉處存在于角質(zhì)層，與角蛋白相互作用增強表皮的屏障功能［5］。角蛋白在維持表皮屏障功能有重要作用。

2.1 滲透屏障：無細胞核的角質(zhì)形成細胞和細胞間的基質(zhì)是維持表皮滲透屏障的兩個關(guān)鍵元素。角蛋白16過度表達可導(dǎo)致表皮松解角化過度癥發(fā)病，其滲透屏障功能遭到嚴重破壞。角蛋白16過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠皮損也與表皮松解性角化過度癥皮損相似。研究發(fā)現(xiàn)，角蛋白16高表達小鼠表皮水分喪失增加兩倍以上，其屏障功能修復(fù)速度較角蛋白16不表達的小鼠和正常小鼠也延遲2倍。這些研究表明，角蛋白16不僅維持細胞結(jié)構(gòu)、決定細胞分化，也會延遲屏障功能恢復(fù)速度［6］。

AD常伴隨著角蛋白16的高表達，該病患者病變部位皮膚滲透屏障功能嚴重受損，未受累皮膚屏障功能也會受到不同程度破壞。在AD患者中，受累皮膚較正常皮膚明顯變薄，化學(xué)敏感性增加，病變皮膚表皮水分喪失是非病變皮膚的2～5倍。在AD患者皮損和非皮損部位檢測到表皮鞘磷脂酶、DNA的合成、絲聚蛋白和角蛋白的表達與正常皮膚有明顯區(qū)別。N鞘磷脂酶的活性在AD患者的皮損內(nèi)顯著降低，從而影響角蛋白正常表達，導(dǎo)致皮膚屏障功能進一步受損。在AD患者皮損與非皮損部位還可以檢測到角蛋白16和角蛋白5的高表達，角蛋白6和角蛋白17僅在受損的皮膚中高表達。大麻受體介導(dǎo)的信號能夠抑制角蛋白16在AD患者中的表達，也證明了角蛋白16與AD發(fā)病有必然的聯(lián)系［7］。

角蛋白16對維護和修復(fù)表皮屏障功能也有重要作用。角蛋白16過度表達減少細胞連接的數(shù)量，導(dǎo)致細胞松解，直接影響屏障功能。角蛋白16過度表達破壞脂類和酶分泌方式，導(dǎo)致其不能及時分泌到角質(zhì)形成細胞間隙，還影響著角蛋白6、角蛋白17表達水平，間接影響屏障修復(fù)的效率。

2.2 免疫屏障：

2.2.1 角蛋白 16對損傷相關(guān)分子模式（DAMPS）的調(diào)節(jié)：表皮的免疫屏障是指表皮受到損害時通過調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)［8］維持機體健康的方式。當(dāng)機體受到損害時，角質(zhì)形成細胞首先發(fā)出第一信號DAMPS 或“警戒素”（alarmins），在皮膚屏障功能受到威脅時啟動一系列防御［9］。DAMPS是包括S100在內(nèi)的一個多元化家族蛋白群體，包括抗菌肽、細胞選擇因子和趨化因子等，在病原體入侵時由角質(zhì)形成細胞直接分泌。當(dāng)皮膚受到損害時，DAMPS還能通過激活免疫細胞（例如樹突細胞，中性粒細胞，巨噬細胞，T細胞）、調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生途徑增強皮膚屏障功能［10］。

角蛋白16是絲裂原活化蛋白激酶和EGF調(diào)節(jié)的靶向基因［11］，其表達程度決定了DAMPS的水平；角蛋白16還是核因子E2相關(guān)因子（Nrf）2轉(zhuǎn)錄因子的直接目標(biāo)。Nrf2是皮膚中活性氧簇和氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。在大齡鼠中，Nrf2的異常調(diào)節(jié)會增加腫瘤的發(fā)生率［12］，加重皮膚的炎癥反應(yīng)繼而影響皮膚屏障功能［13］；在子宮內(nèi)，Nrf2通過調(diào)節(jié)Sprr2d和Sprr2h促進表皮屏障功能的修復(fù)［14］。用12-〇-十四烷酰佛波醋酸酯-13處理角蛋白16基因敲除小鼠的耳部，可以觀察到高水平的Sprr2d和血紅素氧合酶-1，表明 Nrf2介導(dǎo)氧化反應(yīng)的激活，說明了角蛋白16在角質(zhì)形成細胞中的防御作用。

2.2.2 角蛋白16對角蛋白1、6、17的介導(dǎo)：角蛋白16不僅調(diào)節(jié)DAMPS，還會加快角質(zhì)形成細胞介導(dǎo)角蛋白1、6和17轉(zhuǎn)錄。這些角蛋白不僅維持著角質(zhì)形成細胞的物理韌性，保障表皮屏障功能也發(fā)揮著重要作用。角蛋白1、Ⅱ型角蛋白表達于表皮分化層，可以控制炎癥活動，影響角質(zhì)形成細胞對白細胞介素（IL）18、S100A8和S100A9的分泌量。角蛋白6通過與Src激酶相互作用影響細胞遷移［15］，而角蛋白17挽救受損的角質(zhì)形成細胞，增加其存活率，促進其生長。Th1/Th17是占主導(dǎo)地位的免疫因子，可以預(yù)防皮膚基底樣腫瘤的發(fā)生［16］。

2.2.3 角蛋白16激活調(diào)節(jié)通路：當(dāng)皮膚受到外界的刺激時，角蛋白16還參與了調(diào)節(jié)通路的激活。角質(zhì)形成細胞分化過程中，IL-1a參與多肽類基因轉(zhuǎn)錄，與絲裂原活化蛋白激酶［17］相互作用刺激角質(zhì)形成細胞增殖和表皮炎癥產(chǎn)生。當(dāng)角蛋白16缺失時，IL-1a信號通路的異常和炎癥回饋增強，導(dǎo)致皮膚屏障功能進一步損害。而且IL-1a受體、EGF受體存在于生物膜表面［18］，隨著角蛋白 6 變化而發(fā)生變化［15，18］。當(dāng)角蛋白16缺乏時，生物膜表面的一些激酶不能夠?qū)⑼饨绲拇碳づcErk1/2、細胞因子及時聯(lián)系一起［19］，導(dǎo)致機體損害加劇。角蛋白16的缺失還會導(dǎo)致炎癥細胞包括CD4+T細胞，單核細胞，巨噬細胞和中性粒細胞聚集，很少出現(xiàn)在無毛囊結(jié)構(gòu)皮膚中的CD207+朗格漢斯細胞也會在病變區(qū)聚集［20］。

2.2.4 角蛋白16轉(zhuǎn)基因小鼠受到化學(xué)或物理刺激時DAMPS的表達：實驗表明，K16基因敲除小鼠受到急性炎癥或物理刺激時，表皮的屏障功能會受到嚴重損傷，這是由于角質(zhì)形成細胞中缺乏角蛋白16，無法正常調(diào)節(jié)體內(nèi)提呈的危險信號，導(dǎo)致過度表達DAMPS和皮膚屏障功能相關(guān)的調(diào)節(jié)因子。這些研究結(jié)果揭示了角蛋白16在先天性免疫中的作用。各種對皮膚的刺激可導(dǎo)致角蛋白16早期激活，說明角蛋白16與皮膚急性炎癥的發(fā)展有著重要聯(lián)系［21］。

用12-〇-十四烷酰佛波醋酸酯-13刺激正常小鼠耳朵可導(dǎo)致炎癥因子和皮膚屏障功能相關(guān)基因高表達，這與角蛋白16基因敲除小鼠前爪病變相似。用12-〇-十四烷酰佛波醋酸酯-13刺激角蛋白16基敲除小鼠的皮膚，基因表達發(fā)生折疊性變化并著重突出了DAMP（表皮胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素、S100A7A、DefB4），細胞因子（CCL5、IL-1α），Sprr2d，HO-1，和SFN的誘導(dǎo)。用丙酮刺激轉(zhuǎn)基因小鼠48 h后，小鼠皮膚屏障功能同樣遭到了破壞。角蛋白16基因敲除小鼠的耳部皮膚觀察到 IL-1b、Ccl2、Ccl5和血紅素氧合酶1 mRNA水平降低，而角蛋白17基因敲除小鼠的皮膚經(jīng)刺激后，這些mRNA水平未發(fā)生明顯變化。

2.2.5 遺傳學(xué)系統(tǒng)分析K16基因、DAMPS與皮膚屏障關(guān)系：通過遺傳學(xué)系統(tǒng)分析K16基因、DAMPS與皮膚屏障關(guān)系，證實角蛋白16、DAMPS和皮膚屏障功能調(diào)節(jié)因子是緊密關(guān)聯(lián)的。在角蛋白16基因敲除小鼠皮膚中，發(fā)現(xiàn)角蛋白6a、S100A8、S100A9、DefB3、SerpinB3a和Stfa1異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致皮膚的屏障功能受損。對全基因組和基因表達譜研究也表明，角蛋白16在炎癥和癌癥易感性方面起著重要作用［22］。通過電子顯微鏡可以觀察角蛋白16基因敲除小鼠前爪角質(zhì)形成細胞破裂或裂解也證實了角蛋白16的功能。Ⅰ型角蛋白16和Ⅱ型角蛋白6（6a、6b）突變可以導(dǎo)致先天性厚甲癥，其發(fā)病的病理生理變化與角蛋白16轉(zhuǎn)基因小鼠相似，屏障功能受到嚴重損害。

3 結(jié)語

角蛋白16在維持皮膚屏障功能方面起重要作用，當(dāng)其異常表達時，皮膚滲透屏障功能和免疫屏障功能可能會受到影響，從而引起相應(yīng)的皮膚炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。因此，深入了解角蛋白16在皮膚屏障功能中的作用和意義，可為臨床提供更多治療和預(yù)防的靶點。

［1］ de Mare S,van Erp PE,Ramaekers FC,et al.Flow cytometric quantification of human epidermal cells expressing keratin 16in vivoafter standardized trauma［J］.Arch Dermatol Res,1990,282（2）:126-130.

［2］ Moch M,Herberich G,Aach T,et al.Measuring the regulation of keratin filament network dynamics ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110（26）:10664-10669.DOI:10.1073/pnas.1306020110.

［3］ Trost A,Desch P,Wally V,et al.Aberrant heterodimerization of keratin 16 with keratin 6A in HaCaT keratinocytes results in diminished cellular migration ［J］.Mech Ageing Dev,2010,131（5）:346-353.DOI:10.1016/j.mad.2010.04.002.

［4］ Wang YN,Chen YJ,Chang WC.Activation of extracellular signal-regulated kinase signaling by epidermal growth factor mediates c-Jun activation and p300 recruitment in keratin 16 gene expression［J］.Mol Pharmacol,2006,69（1）:85-98.DOI:10.1124/mol.105.016220.

［5］ Kitajima Y.New insights into desmosome regulation and pemphigus blistering as a desmosome-remodeling disease ［J］.Kaohsiung J Med Sci,2013,29 （1）:1-13.DOI:10.1016/j.kjms.2012.08.001.

［6］ Presland RB,Coulombe PA,Eckert RL,et al.Barrier function in transgenic mice overexpressing K16,involucrin,and filaggrin in the suprabasal epidermis ［J］.J Invest Dermatol,2004,123（3）:603-606.

［7］ Ramot Y,Sugawara K,Zákány N,et al.A novel control of human keratin expression:cannabinoid receptor1-mediated signaling down-regulates the expression of keratins K6 and K16 in human keratinocytesin vitroand in situ ［J］.Peer J,2013,1:e40.DOI:10.7717/peerj.40.

［8］ Coulombe PA,Lee CH.Defining keratin protein function in skin epithelia:epidermolysis bullosa simplex and its aftermath ［J］.J InvestDermatol,2012,132 （3 Pt2）:763-775.DOI:10.1038/jid.2011.450.

［9］ Nestle FO,Di Meglio P,Qin JZ,et al.Skin immune sentinels in health and disease［J］.Nat Rev Immunol,2009,9（10）:679-691.DOI:10.1038/nri2622.

［10］ Lai Y,Gallo RL.AMPed up immunity:how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense ［J］.Trends Immunol,2009,30（3）:131-141.DOI:10.1016/j.it.2008.12.003.

［11］ Kerns M,DePianto D,Yamamoto M,et al.Differential modulation of keratin expression by sulforaphane occurs via Nrf2-dependent and-independent pathways in skin epithelia［J］.Mol Biol Cell,2010,21 （23）:4068-4075.DOI:10.1091/mbc.E10-02-0153.

［12］ DeNicola GM,Karreth FA,Humpton TJ,et al.Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis［J］. Nature, 2011, 475 （7354）: 106-109. DOI:10.1038/nature10189.

［13］ Sch?fer M,Farwanah H,Willrodt AH,et al.Nrf2 links epidermal barrier function with antioxidant defense ［J］.EMBO MolMed,2012,4 （5）:364-379.DOI:10.1002/emmm.201200219.

［14］ Huebner AJ,Dai D,Morasso M,et al.Amniotic fluid activates the nrf2/keap1 pathway to repair an epidermal barrier defect in utero ［J］.Dev Cell,2012,23 （6）:1238-1246.DOI:10.1016/j.devcel.2012.11.002.

［15］ Rotty JD,Coulombe PA.A wound-induced keratin inhibits Src activity during keratinocyte migration and tissue repair［J］.J Cell Biol,2012,197（3）:381-389.DOI:10.1083/jcb.201107078.

［16］ Depianto D,Kerns ML,Dlugosz AA,et al.Keratin 17 promotes epithelial proliferation and tumor growth by polarizing the immune response in skin［J］.Nat Genet,2010,42（10）:910-914.DOI:10.1038/ng.665.DOI:10.1038/ng.665.

［17］ Kyriakis JM,Avruch J.Mammalian MAPK signal transduction pathways activated by stress and inflammation:a 10-year update［J］.Physiol Rev,2012,92（2）:689-737.DOI:10.1152/physrev.00028.2011.

［18］ Wong VW,Akaishi S,Longaker MT,et al.Pushing back:wound mechanotransduction in repair and regeneration ［J］.J Invest Dermatol, 2011, 131 （11）: 2186-2196. DOI:10.1038/jid.2011.212.

［19］ Wong VW,Rustad KC,Akaishi S,et al.Focal adhesion kinase links mechanical force to skin fibrosis via inflammatory signaling［J］.Nat Med,2011,18（1）:148-152.DOI:10.1038/nm.2574.

［20］ Lessard JC,Coulombe PA.Keratin 16-null mice develop palmoplantar keratoderma,a hallmark feature of pachyonychia congenita and related disorders［J］.J Invest Dermatol,2012,132（5）:1384-1391.DOI:10.1038/jid.2012.6.

［21］ Lessard JC,Pi?a-Paz S,Rotty JD,et al.Keratin 16 regulates innate immunity in response to epidermal barrier breach ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110 （48）:19537-19542.DOI:10.1073/pnas.1309576110.

［22］ Lee P,Lee DJ,Chan C,et al.Dynamic expression of epidermal caspase 8 simulates a wound healing response［J］.Nature,2009,458（7237）:519-523.DOI:10.1038/nature07687.87.

Roles of keratin 16 in skin barrier function

Li Shuai,Zhang Jianzhong,Li Yuzhen.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China

Li Yuzhen,Email:liyuzhen@medmail.com

K16,one of the major structural proteins of keratinocytes,plays an important role in maintaining cellular function and skin barrier function.K16 expression is highly dependent on cellular state and differentiation degree of keratinocytes.Differences exist in K16 expression levels among different types of epithelial cells.When K16 is abnormally expressed,skin barrier function is damaged to different extents at lesional sites,and is also affected in uninvolved skin.Aberrant expression of K16 not only affects skin permeability barrier function,but also causes inflammatory skin reactions and immune responses,resulting in further damage to the human body.

Keratin-16;Keratinocytes;Osmosis;Immunity;Barrier

2014-08-11）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.015

栗玉珍，Email:liyuzhen@medmail.com

本文主要縮寫：EGF：表皮生長因子，AD：特應(yīng)性皮炎，DAMPS：損傷相關(guān)分子模式，Nrf：核因子-E2相關(guān)因子