程 丹 湯紹遷

微小RNA在肝纖維化中作用的研究進展

程 丹 湯紹遷

微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，是調控蛋白質生物合成的一類重要的非編碼RNA。關于miRNA在肝纖維化中的作用一直是近年來的研究熱點。已有研究發(fā)現，miRNA在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中存在異常表達，并在調控肝纖維化相關的信號通路和肝星狀細胞(HSC)的增殖、分化和凋亡中起重要作用。此文就近年來有關miRNA在肝纖維化中作用的研究進展作一綜述。

肝纖維化；miRNA；肝星狀細胞

肝纖維化是由各種病因(肝炎病毒、乙醇、血吸蟲及藥物等)所致的慢性肝損傷的共同病理改變，是慢性肝病進展為肝硬化的必經階段。各種致病因素會引發(fā)肝細胞損傷、壞死及炎性反應，激活肝臟內的巨噬細胞(如庫普弗細胞)，并分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-6等多種細胞因子，共同作用于肝星狀細胞(HSC)，促使HSC轉變?yōu)榛罨腍SC，即肌成纖維細胞(MFB)，MFB加速了細胞外基質(ECM)蛋白[包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原蛋白、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)和肌間線蛋白]的合成與沉積，并最終導致肝纖維化[1]。隨著對肝纖維化病理的深入認識，現認為肝纖維化是可以逆轉的，甚至連肝硬化在某些情況下也是有可能逆轉的[2]，并且這種逆轉已經在由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及其他原因所導致的肝硬化患者中觀察到[3-4]。 但是，由于肝纖維化的過程不易被察覺，以至于多數患者發(fā)現時已進展為肝硬化，加大了治療的難度。因此，如何在早期及時、有效地診斷肝纖維化，對于眾多肝病患者而言具有重大意義。

近年來研究發(fā)現，微小RNA(miRNA)可參與并調節(jié)肝纖維化的進程，在HSC的激活及肝纖維化相關信號通路中發(fā)揮著重要作用。Zhang等[5]收集了慢性乙型肝炎和肝硬化患者的血漿，通過miRNA微陣列檢測不同分組的循環(huán)miRNA的表達量，發(fā)現了12種在所有分組中均出現異常表達的miRNA，包括10種上調的miRNA以及2種下調的miRNA。有關miRNA在肝纖維中的作用已成為近年來的研究熱點。

1 miRNA 的合成及其作用機制

真核生物細胞內的miRNA主要有兩種來源：大部分的miRNA可通過特定的基因轉錄加工而產生；另一小部分miRNA可以從內含子或長鏈非編碼RNA(lncRNA)中產生。許多miRNA都具有自身的獨立基因，通過RNA聚合酶Ⅱ(RNase Ⅱ)轉錄產生特異性的轉錄產物，這是miRNA產生的經典途徑。在RNase Ⅱ的催化作用下，轉錄產生初級前體miRNA(pri-miRNA)，然后經過5′-端加帽，3′-端加poly A尾[6]。pri-miRNA 在RNase Ⅲ(Drosha)的催化下與雙鏈RNA結合蛋白DGCR8形成Drosha-DGCR8復合物，將pri-miRNA加工成一個約70 nt，含有發(fā)卡結構的前體，稱為pre-miRNA[7]。pre-miRNA被隨機轉運至胞質中，在RNase Ⅲ(Dicer)催化下與雙鏈RNA結合蛋白TRBP結合形成復合物，在TRBP協(xié)助下，Dicer將pre-miRNA進一步裂解產生一個20 bp的miRNA/miRNA*雙鏈分子[8]。加工產生的短雙鏈RNA中的一條將與AG01/AG02結合并留在RISC中形成miRNA誘導的沉默復合體(miRISC)，從而行使miRNA的功能，而另一條鏈則被釋放降解。

miRNA的主要功能是在翻譯水平調控蛋白質編碼基因的表達，且以負調控作用為主。miRNA調控基因表達主要是通過miRNA以不完全互補的方式引導miRISC結合靶mRNA，與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結合并阻止其翻譯；如果miRNA與mRNA的靶序列完全互補，則通過miRISC中的AG02發(fā)揮內切核酸酶作用，促進其降解[9-10]。

2 miRNA參與HSC的活化、增殖和凋亡

HSC的激活是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)，也是肝纖維化的主要效應細胞[1,11]，近年來體外及體內的研究表明，miRNA在HSC的激活中起著重要作用。

2.1 miRNA調節(jié)HSC活化

近期一項研究發(fā)現，在肝硬化患者和硫代乙酰胺(TAA)或 四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠纖維化模型的肝組織中，miR-21均呈高水平表達；下調miR-21和活化蛋白-1(AP-1)的表達后可觀察到HSC的活化顯著受到抑制，纖維化的程度則得以緩解；相反，用小干擾RNA抑制程序性細胞凋亡因子4(PDCD4)的表達后，則可以促進HSC向成纖維細胞轉變，加速肝纖維化的進程，提示miR-21可通過miR-21/PDCD4/AP-1反饋回路維持其在肝纖維化過程中的高表達水平，并促進 HSC的活化[12]。Maubach等[13]通過體內及體外的研究發(fā)現，與處于靜態(tài)的HSC相比較，激活后10 d的HSC中有16種miRNA表達上調及26種miRNA表達下調。Lakner等[14]通過miRNA微陣列分析對比處于活化和未活化狀態(tài)下HSC中miRNA的表達量，發(fā)現miR-34c、miR-184和miR-221的表達顯著上調，而另有8種miRNA(miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR-150和miR-194)的表達則顯著下調。Yan等[15]檢測了HSC處于絕對靜態(tài)的前3 d及激活后10 d的miR-34a和轉錄因子ACSL1的表達量，以及miR-34a沉默后HSC中ACSL1的表達量，發(fā)現miR-34a可能是通過直接靶向調節(jié)ACSL1的表達而參與肝纖維化進程。

2.2 miRNA調節(jié)HSC的凋亡

Zheng等[16]通過基因微陣列發(fā)現miR-150在肝纖維化中的表達顯著降低，而在LX-2細胞株中高表達miR-150會抑制細胞的增殖，并減少ECM以及α-SMA的生成，提示miR-150在調節(jié)HSC的凋亡，抑制肝纖維化中起著重要作用。Dai等[17]的體外實驗研究顯示，在肝硬化患者的肝組織、血清以及活化的HSC中均發(fā)現miR-155的表達降低，而在高表達miR-155后發(fā)現HSC的凋亡顯著增加，并且抑制了上皮間質轉化(EMT)以及細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1)信號通路的活性。在大鼠肝纖維化組織中，miR-150和miR-194同樣被發(fā)現在HSC中表達降低，而使其過表達后則會顯著抑制HSC的增殖，并減少α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的生成[18]。Wang等[19]通過體外實驗證實，miR-29在LX-2 HSC、LX-1以及HSC-T6細胞株中高表達后，會顯著抑制HSC的增殖并促進其凋亡。

3 miRNA在肝纖維化相關信號通路中的作用

目前研究表明，肝纖維化是一個復雜的病理變化過程，受到多種信號通路及細胞因子的調節(jié)，包括TGF-β/Smad、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-κB)以及Wnt/β-catenin等信號通路。

3.1 miRNA在TGF-β/Smad通路中的作用

TGF-β具有多種生物學作用，可參與細胞增殖、分化、凋亡、ECM沉積及ECM蛋白的合成和降解，是調控機體器官纖維化的核心通路[20]，其中TGF-β1/Smad信號轉導通路是調節(jié)ECM基因表達以及促進ECM生成的重要途徑[21-22]。Tu等[23]通過對大鼠肝纖維化模型的研究發(fā)現，miR-101可以抑制TGF-βⅠ型(TβRⅠ)在肝細胞和HSC中的表達，從而阻斷TGF-β信號通路在肝纖維化中的作用，進而促進活化的HSC逆轉為靜態(tài)的HSC；同時，在人肝細胞中，miR-101也可以通過阻止TGF-β信號通路的轉導而抑制肝纖維化相關細胞因子的釋放。Lakner等[14]研究發(fā)現，將大鼠活化的HSC中miR-19b的表達水平提高后，TGF-β通路中的組成成分TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)的表達量顯著降低，同時降低了Ⅰ型膠原蛋白的表達以及TGF-β介導的α1和α2型膠原蛋白mRNA的表達，表明miR-19b可以抑制HSC中的TGF-β信號通路的活性。Roy等[24]在研究miR-30c和miR-193在肝纖維化中的作用時發(fā)現，TGF-β2和Snail1(調控ECM的關鍵因子)可能是miR-30c和miR-193的兩個作用靶點。

3.2 miRNA在PI3K/Akt通路中的作用

PI3K/Akt通路是一條經典的信號轉導途徑，在肝纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，通過調節(jié)ECM的降解，可影響HSC的增殖和凋亡，參與肝纖維化的形成[25]。Wang等[19]將miR-29b轉導入CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中并使其高表達后，發(fā)現miR-29b可調控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)并誘導HSC凋亡，且miR-29b可通過直接結合PIK3R1和Akt3的3′端UTR區(qū)域而抑制PI3K/Akt的信號轉導。進一步研究發(fā)現，在敲除了PIK3R1或Akt3基因后會抑制α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達并誘導HSC的凋亡，表明miR-29b可以通過抑制PI3K/Akt信號通路，阻止HSC的激活并誘導其凋亡，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Xiao等[26]在研究miR-200b在人HSC系LX-2中的作用時發(fā)現，miR-200b可以提高Akt的磷酸化水平，用miR-200b模擬物(miR-200b mimic) 使其高表達后發(fā)現FOG2(miR-200b的靶蛋白，可以抑制PI3K/Akt通路的活化)的表達水平顯著降低，表明miR-200b可通過下調FOG2而激活PI3K/Akt通路，進而刺激HSC的生長和遷徙。Wei等[27]在研究miR-21在人HSC系LX-2中的作用時發(fā)現，上調miR-21的表達會刺激LX-2的增殖；相反，下調miR-21的表達則會抑制LX-2的增殖，同時發(fā)現miR-21的高表達會抑制LX-2細胞中PTEN蛋白的表達，進而激活Akt蛋白，而用miR-21的抑制劑LY294002抑制Akt信號通路后，可以阻止LX-2細胞的纖維化，表明miR-21可以通過調節(jié)PI3K/Akt信號轉導通路而影響LX-2細胞的纖維化進程。

3.3 miRNA在NF-κB通路中的作用

NF-κB能通過調控多種炎性因子以及抗炎因子的表達來影響肝臟炎性反應的損傷修復，從而調節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展；同時，NF-κB還能通過影響HSC的凋亡而參與肝纖維化的進程[28-29]。Feng等[30]研究了miR-126在LX-2細胞系中的作用機制，利用miR-126類似物或抑制劑上調或下調miR-126表達后，觀察NF-κB蛋白、NF-κB抑制劑α(IκBα)的mRNA和蛋白的表達量以及NF-κB通路的下游信號分子TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達量，最終發(fā)現miR-126可以抑制IκBα的表達；相反，敲除miR-126基因則會上調IκBα的表達并抑制NF-κB信號通路的激活，進而影響肝纖維化的進程。Hyun等[31]在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型研究中發(fā)現，miR-378a-3p的表達明顯降低，將miR-378a-3p過表達后會顯著抑制HSC的活性；使用Smoothened激活NF-κB p65及其信號通路后，發(fā)現miR-378a-3p的表達明顯降低，表明miR-378a-3p在NF-κB信號通路的調控下可以影響HSC的活化，進而參與肝纖維化。

4 小結與展望

近年來隨著對肝纖維化研究的深入，miRNA在肝纖維化進展、HSC活化和凋亡以及其相關信號通路中的作用越來越明確，這為肝纖維化患者的診斷及治療提供了新的靶點，具有十分重要的臨床意義。但目前仍有許多問題亟待解決，比如之前的研究大多局限于體外實驗，如何在早期有效診斷肝纖維化，miRNA能否作為一個早期診斷肝纖維化的生物學指標，這些問題都需要進一步的深入研究。相信隨著臨床試驗的進展，終究會克服肝纖維化診斷及治療方面的難題。

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(本文編輯：周駿)

434020 湖北荊州，長江大學第二臨床醫(yī)學院 荊州市中心醫(yī)院消化內科

湯紹遷，Email: jz-tsq@163.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.06.004

2016-06-12)