吳瑾 楊春生 周武軍

·綜述·

誘導多能干細胞在皮膚病研究的應用進展

吳瑾 楊春生 周武軍

誘導多能干細胞是將一系列轉錄因子轉入動物或人多種分化成熟的體細胞，經過重組的程序誘導獲得多能干細胞，其在形態(tài)、增殖能力、表面抗原、基因和蛋白表達、分化能力等方面與胚胎干細胞相似，因此，科研工作者利用誘導多能干細胞代替胚胎干細胞來研究皮膚病。因誘導多能干細胞除具有多能性還具有無限增殖的能力，這些特性能使研究者獲得無限的特定細胞，進而建立遺傳性皮膚病模型。將致病的突變基因在誘導多能干細胞水平矯正，矯正后的誘導多能干細胞能產生基因正常的健康皮膚組織細胞，從而可望治療遺傳性皮膚病。

皮膚疾病；誘導多能干細胞；遺傳；基因；治療應用

誘導多能干細胞（iPS細胞）最初是2006年日本科學家Yamanaka等把八聚體結合轉錄因子4（Oct4）、性別決定區(qū)盒子2、髓細胞瘤病病毒癌基因同系物、Kruppel樣因子4轉錄因子基因克隆入病毒載體，引入小鼠成纖維細胞使其重編程，進而發(fā)現(xiàn)可誘導其發(fā)生轉化，產生的iPS細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似［1］。后來一系列研究還發(fā)現(xiàn)，除上述4種病毒整合載體外，Nanog和Lin28的病毒整合載體，以及Oct4，性別決定區(qū)盒子2，Kruppel樣因子4和髓細胞瘤病病毒癌基因同系物的非整合病毒載體或質粒載體分別在小鼠和人多種分化細胞中成功誘導出iPS細胞。鼠和人的iPS細胞在細胞形態(tài)、分子標記和分化發(fā)育特點等方面與胚囊來源的胚胎干細胞有著相似的特征［2-3］。

作者單位：223002江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院皮膚性病科

1 皮膚細胞誘導產生iPS細胞

獲得iPS細胞最常見方式是通過小塊皮膚組織的成纖維細胞（包括小鼠和人皮膚組織）經干細胞轉錄因子重組誘導獲得。

2008 年，Lowry 等［4］報道了由患者個體組織培養(yǎng)獲得的真皮成纖維細胞誘導得到患者特定的iPS細胞。2011 年，Huang等［5］發(fā)現(xiàn)，通過腺病毒介導的過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子過表達，可以是皮下脂肪細胞僅在Oct4/性別決定區(qū)盒子2/Kruppel樣因子4誘導下獲得iPS細胞，這減少了由髓細胞瘤病毒癌基因同系物引起的致癌風險。同年，Tsai等［6］發(fā)現(xiàn)，人毛乳頭細胞幾乎表達除了Oct4之外的所有重組因子，通過應用Oct4單種干細胞轉錄因子（Oct4）可將人毛乳頭細胞誘導為iPS細胞，這在一定程度上減少了基因過表達引起突變的危險及危害。2015年，Hung等［7］通過簡單的非創(chuàng)傷性方法（拔取頭發(fā)）培養(yǎng)的角質形成細胞應用非整合型附著體載體誘導得到iPS細胞。由此可見，皮膚細胞尤其是拔發(fā)獲得的毛乳頭細胞及皮下脂肪細胞，是獲得iPS細胞的誘導優(yōu)勢細胞，不僅取材方便，而且可以避免在成熟體細胞誘導過程中過多的表達干細胞轉錄因子，減少癌變的可能，有利于臨床進一步應用。

2 iPS細胞誘導分化產生皮膚細胞

目前，已有研究者通過應用維A酸和成骨蛋白4改變iPS細胞的培養(yǎng)環(huán)境，將其定向分化為角質形成細胞［8-9］，這些細胞完整表達角質形成細胞標記物，如角蛋白14和末端蛋白63，并可通過熒光標記物抗體篩選出高純度的角質形成細胞。iPS細胞定向分化的角質形成細胞在體外能形成完整的表皮組織，種植在免疫缺陷小鼠同樣會產生完整的表皮。除角質形成細胞，其他的人皮膚組成細胞如黑素細胞及成纖維細胞均可以由iPS細胞定向分化獲得［10-11］。將3種重要的皮膚細胞即角質形成細胞、成纖維細胞、黑素細胞混合培養(yǎng)有可能產出完整的功能性人皮膚組織。

除可以產生表皮，iPS細胞技術還能用于獲得皮膚附屬器。有研究證實，人iPS細胞來源的外胚層祖細胞在體內可以形成毛囊結構。他們將iPS細胞來源的外胚層祖細胞和鼠毛乳頭細胞一起種植在免疫缺陷鼠，幾周后發(fā)現(xiàn)形成了新的毛囊［12-13］。iPS細胞技術使得獲得特定多潛能干細胞，并用于移植治療且無免疫排斥成為可能。

iPS細胞通過一種重組程序而獲得，這種重組程序能誘導一系列的干細胞轉錄因子進入成熟體細胞，如真皮成纖維細胞，從初始誘導到iPS細胞特定的克隆形態(tài)形成大約需14～21 d，這些克隆除具有多能性，其另一重要特征是其可以無限的增殖。因此，可以通過一小塊皮膚組織標本就能獲得無限的iPS細胞；然后又可將這些iPS細胞定向分化為各種類型的成體細胞。如將iPS細胞直接分化為表皮角質形成細胞。通過體外3D皮膚培養(yǎng)或體內異種移植至免疫缺陷小鼠培養(yǎng)技術，可以運用iPS細胞誘導獲得角質形成細胞構建皮膚組織［14-15］。目前的技術還能使研究者通過iPS技術來糾正遺傳性皮膚病中的基因突變，從而為基因遺傳性皮膚病患者進行替代治療。這種技術的一個重要優(yōu)點是這種方法治療后的患者不會出現(xiàn)免疫排斥反應。

3 iPS細胞結合基因編輯技術用于皮膚病的治療

目前的研究已證實，iPS細胞的一個重要特性是其具有無限增殖的能力，可以模擬出各種人類遺傳性皮膚病的疾病模型［14-15］。治療人類遺傳病的基本方案如下：①患者特定的iPS細胞可以由患者體細胞獲得；②如果有基因缺陷可通過基因打靶技術糾正患者iPS細胞的缺陷基因；③糾正后的iPS細胞被直接分化為目的細胞；④純化的目的細胞用于臨床移植治療。應用iPS細胞技術治療遺傳性皮膚病是從該患者身上獲得基因突變的iPS細胞，通過基因糾正將iPS細胞定向分化為正常的皮膚組織細胞。這個過程中，基因突變須在體外糾正，可以通過特定序列DNA核苷酸來完成，設計這種核苷酸（如TALE核酸酶［16］）是為了切除特定的DNA序列。這些核苷酸通過包含正確DNA序列的質粒被誘導入患者細胞，即同源組合就能使引起疾病的點突變得到修正［14-15］?；蚣m正后的iPS細胞會提供一個理想的細胞來源，通過定向分化可獲得大量患者自身特定的（具有很好的免疫耐受性）健康皮膚的移植物，因此，這種基因糾正的方法可通過iPS細胞實現(xiàn)。Tolar等和Osborn等［17-18］兩個研究組證實，可以從患有隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥的患者獲得基因突變的iPS細胞。隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥是由COL7A1基因突變引起的，該基因編碼膠原蛋白Ⅶ，導致皮膚水皰的形成。研究者先獲得患者iPS細胞，進行基因糾正，然后由糾正后的iPS細胞定向分化獲得角質形成細胞形成皮膚組織塊，因此，研究者能提供充足的證據(jù)證實，通過iPS細胞技術能為隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥患者獲得大量臨床正常表皮。

4 iPS 細胞的優(yōu)缺點［19］

iPS細胞與胚胎干細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面均相似，因此，可以通過iPS細胞的無限增殖性等優(yōu)勢來研究正常人體的發(fā)育以及機體發(fā)生疾病的分子病理機制。然而，iPS細胞畢竟不等同于胚胎干細胞，在誘導以及體外培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)各種問題。

4.1 iPS技術的優(yōu)點：①iPS細胞可由少量的皮膚組織誘導獲得；②iPS細胞在體外可以無限的增殖，提供大量的細胞來源；③iPS細胞可以分化為各種細胞類型；④由iPS細胞分化獲得的細胞能用于疾病模型和藥物篩選；⑤基因突變引起的皮膚病可以在iPS細胞中糾正突變基因；⑥由iPS細胞衍生而來的細胞如角質形成細胞可以用于細胞治療；⑦應用iPS細胞分化的成體細胞避免了由胚胎干細胞引起的倫理問題。

4.2 iPS技術的缺點：①iPS細胞在體外重組培養(yǎng)的過程中可能會發(fā)生基因組的突變；②未分化的iPS細胞，如果輸入患者體內會引起腫瘤（畸胎瘤）；③在臨床應用之前，必須有標準化步驟來規(guī)范iPS細胞的產生、維持、分化等。

5 結語

研究者可以通過遺傳性皮膚病患者來源的iPS細胞定向分化獲得角質形成細胞，同時獲得一些與基因突變引起的與疾病相一致的疾病模型系統(tǒng)，這個系統(tǒng)能在RNA、蛋白質及功能水平評估疾病。此外，這種方法能獲得患者自身細胞基礎的篩選系統(tǒng)，從而使患者的角質形成細胞缺陷獲得矯正成為可能。從長遠來看，這種技術能用于產生患者自身來源的、基因糾正后的皮膚組織細胞，從而可移植到iPS細胞來源的患者。因此，這可能會為基因遺傳病，如皮膚皰病或皮膚變脆性疾病提供新的治療方案。

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Application of induced pluripotent stem cells in studies of skin diseases

Wu Jin,Yang Chunsheng,Zhou Wujun.Department of Dermatovenereology,Second People′s Hospital of Huai'an,Huai'an 223002,Jiangsu,China

Induced pluripotent stem cells （iPSCs） are generated through a process termed“reprogramming”,in which a set of transcription factors were introduced into multiple mature animal or human somatic cells.Since iPSCs are similar to embryonic stem （ES） cells in morphology,proliferation,surface antigens,gene and protein expressions,differentiation potency and so on,they are used instead of ES cells to study skin diseases.In addition to pluripotency,iPSCs also have indefinite proliferative potential,and specific cells can be achieved indefinitely by using the potentials of iPSCs to establish models for genetic skin diseases.Furthermore,pathogenic mutations can be corrected in iPSCs,which can then be used to generate gene-corrected normal skin cells for the treatment of genetic skin diseases.

Skin diseases;Induced pluripotent stem cells;Heredity;Genes;Therapeutic uses

Zhou Wujun,Email:pifukewujin@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.04.018

周武軍，Email:pifukewujin@sohu.com

本文主要縮寫：iPS細胞：誘導多能干細胞，Oct4：八聚體結合轉錄因子4，BMP4：成骨蛋白4，RDEB：隱性遺傳全身性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥

2015-08-10）