王熙濤, 李淑英, 王麗麗, 李曉宇, 徐永平,*

(1.動物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧 大連 116620；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116620；3.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

刺參海帶飼料原料褐藻膠降解菌的分離與鑒定

王熙濤1,2, 李淑英2, 王麗麗3, 李曉宇3, 徐永平1,2,3*

(1.動物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧 大連 116620；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116620；3.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

從海帶及刺參養(yǎng)殖環(huán)境中篩選有效降解褐藻膠,且對刺參無致病性的微生物，對海帶飼料原料進行降解處理，以降低海帶飼料中刺參難以消化的褐藻膠成分，顯著提高飼料利用率，增加海帶原料價值。以褐藻膠為唯一碳源選擇培養(yǎng)基初篩；DNS法測定褐藻膠裂解酶酶活；16S rDNA測序及生理生化試驗對菌種進行鑒定；高濃度腹腔攻毒試驗考察篩選所得菌株對刺參的潛在致病性；分子排阻色譜及高效凝膠色譜法對微生物酶解褐藻膠的終產(chǎn)物進行分析。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株WB1與Bacillusamyloliquifaciens有最高同源性,對刺參無潛在致病性；其褐藻膠裂解酶酶解褐藻膠的終產(chǎn)物主要為二糖和三糖，相對含量分別為74.1%和25.9%，平均分子量為516 Da。解淀粉芽胞桿菌WB1可作為一種安全的有益微生物用于刺參海帶飼料原料中褐藻膠成分的降解。

刺參；解淀粉芽胞桿菌；海帶；褐藻膠

近年來，隨著刺參養(yǎng)殖的高密度集約化發(fā)展, 約占整個養(yǎng)殖成本70%以上的飼料問題成為刺參養(yǎng)殖的瓶頸。其中優(yōu)質(zhì)餌料匱乏，對飼料利用率低是關(guān)鍵因素之一。鼠尾藻被認為是刺參的最佳優(yōu)質(zhì)餌料，但是隨著鼠尾藻資源的大量開采，現(xiàn)已面臨供不應(yīng)求，價格居高不下的困境[1]。而海帶由于成本低廉、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點[2]也常被用作刺參飼料的主要原料成分之一，但是海帶細胞壁含有大量的褐藻膠，而刺參體內(nèi)的褐藻膠裂解酶活性很低，因此其對海帶等富含褐藻膠的大型藻類消化能力較弱[3-4]，致使大多數(shù)飼料成分未經(jīng)充分消化，便被排出體外，不僅造成飼料的浪費，達不到飼料被充分轉(zhuǎn)化利用的目的，而且水體中大量黏性較高的褐藻膠等殘餌，如果處理不當也會導(dǎo)致刺參養(yǎng)殖環(huán)境的惡化。褐藻膠是海帶、馬尾藻、鼠尾藻、裙帶菜等褐藻類植物細胞壁的重要組成成分及細胞間的填充物質(zhì)，其化學(xué)本質(zhì)是一種多糖類的高分子聚合物[5]。研究表明[6-8]，自然界特別是海洋環(huán)境中存在多種可以降解海帶中褐藻膠的微生物。為解決刺參對價格較低廉、資源豐富的海帶飼料原料利用率不高的問題，本研究擬采取通過從海帶及刺參養(yǎng)殖環(huán)境中篩選分離得到可以有效降解海帶中褐藻膠，且對刺參無致病性的有益微生物，利用其作為降解海帶飼料原料中褐藻膠的目標菌株，以期能有效降低海帶飼料中刺參難以消化的褐藻膠成分，從而提高刺參對海帶飼料原料的利用率，增加海帶作為刺參飼料原料的利用價值。篩選分離的微生物應(yīng)滿足以下兩個特征：①具有有效降解海帶褐藻膠的能力；②對刺參沒有任何潛在的致病性。在上述基礎(chǔ)上，對篩選分離所得微生物的生理生化特性進行分析，為進一步開發(fā)有利于刺參消化吸收的微生物脫膠海帶飼料提供前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗用刺參(平均體重為(10±3.20) g)，購自大連大連灣某刺參養(yǎng)殖場。沙濾海水中暫養(yǎng)2周，不投喂食物，水質(zhì)因子為溶氧≥6 mg/L；溫度控制到(18±1) ℃；鹽度28～30 g/L；pH (8.0±0.4), 每天更換1/3總體積的水體以保證水質(zhì)并吸底排污一次，至刺參不再排便為止。

1.1.2 培養(yǎng)基 褐藻膠固體選擇性培養(yǎng)基：褐藻膠/甘露糖醛酸(褐藻膠M片段)/古羅糖醛酸(褐藻膠G片段)0.5 g，硫酸銨0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.5；褐藻膠液體選擇性培養(yǎng)基：褐藻酸鈉0.5 g，硫酸銨0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，蒸餾水100 mL，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 褐藻膠選擇性培養(yǎng)基進行菌種初篩的方法 ① 從健康刺參腸道中篩菌:利用無菌PBS溶液對解剖所得健康刺參腸道勻漿物進行梯度稀釋，并分別涂布到褐藻膠固體選擇性培養(yǎng)基中，以不含任何碳源的瓊脂平板作為對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，選取菌落生長較大或者有明顯透明圈的菌株進一步劃線純化，重復(fù)上述步驟3次，直至確認所分離菌樣為單一菌株后移入-70 ℃低溫冰箱保藏。② 從海帶病爛處篩菌:從采樣地點收集具有爛邊或明顯腐爛癥狀的海帶樣品，使用接種環(huán)直接從海帶病爛處挑取菌樣，用無菌PBS溶液對菌樣進行梯度稀釋按①中方法進行分離純化。③ 從海泥中篩菌：將海泥樣品用無菌PBS溶液進行梯度稀釋并充分震蕩混勻，按①中方法進行分離純化。

1.2.2 褐藻膠裂解酶活力測定方法(DNS法) 利用DNS法測定菌株褐藻膠液體選擇性培養(yǎng)基中上清液的褐藻膠裂解酶酶活。以反應(yīng)液中還原糖的增加量作為酶活力的檢測指標。還原糖的增加量利用DNS試劑測定。以葡萄糖為標準物做標準曲線，根據(jù)反應(yīng)組和對照組吸光度的差值計算還原糖的生成量。1個酶活力單位定義為反應(yīng)液在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量。

1.2.3 具有褐藻膠降解能力的微生物分類鑒定 ①16S rDNA的PCR擴增：使用SmartTaqPre-Mix 試劑盒擴增16S rDNA，PCR擴增通用引物[9]：27F (5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)；1429R (5′-GGTTAC CTT GTTACGACTT-3′)。 ② 16S rDNA基因測序及菌種鑒定：所得PCR結(jié)果送大連萬澤貿(mào)易有限公司測序。測序結(jié)果使用NCBI的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知種類微生物的16S rDNA基因序列進行比對，確定序列相似性≥95%的最高序列[10]。將所需菌株應(yīng)用MEGA 5.0軟件利用neighbor-joining方法對測得的DNA序列與NCBI上報到的已知序列進行聚類分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[11-12]。

1.2.4 篩選所得菌株的生理生化鑒定及利用褐藻膠的類型 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(第8版)的方法，利用細菌生理生化檢測試劑盒對所篩選菌株的各生理生化指標進行檢測。分別利用褐藻膠甘露糖醛酸(M)和古羅糖醛酸(G)片段代替褐藻膠作為唯一碳源配制選擇性固體培養(yǎng)基，考察菌株利用褐藻膠成分的類型。

1.2.5 篩選所得菌株對刺參的安全性試驗 以濃度分別為5×109、5×108和5×107cfu/mL篩選菌株的菌懸液為試驗組，以滅菌海水為空白對照，以5×108cfu/mL的燦爛弧菌為陽性對照。每組取10只健康刺參于20 cm×15 cm×15 cm的水槽，設(shè)置3個平行組。每只刺參一次腹腔注射100 μL菌液或海水，連續(xù)注射3 d。每日進行觀察，記錄各組刺參生存狀態(tài)，發(fā)病率。實驗期間保持溶氧量≥5 mg/L、溫度(17±1) ℃、鹽度30～32 g/L，14 d后，統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.6 篩選所得菌株的褐藻膠裂解酶對褐藻膠降解終產(chǎn)物的色譜分析 ① 分子排阻色譜法：使用液相色譜儀UltiMate 3000，利用分子排阻色譜法測定降解終產(chǎn)物褐藻寡糖的聚合度。條件如下: 色譜柱：Superdex柱(10 mm×300 mm)；流動相：0.1 mol/L 碳酸氫銨溶液，柱溫：25 ℃; 流速：0.1 mL/min;樣品：褐藻寡糖酶解液；進樣量：20 μL；檢測器：紫外檢測器(230 nm)。② 高效凝膠滲透色譜法(HPGPC):使用液相色譜儀UltiMate 3000，利用高效凝膠滲透色譜法測定降解終產(chǎn)物褐藻寡糖的平均分子量。條件如下：色譜柱：TSKgel PW柱(7.8 mm×300 mm)；流動相：0.1 mol/L硫酸鈉溶液；柱溫：35 ℃，流速：0.5 mL/min；樣品：褐藻寡糖酶解液；進樣量：20 μL；檢測器：示差折光檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠降解菌株的初篩及16S rDNA基因序列鑒定結(jié)果

利用褐藻膠選擇性瓊脂平板初篩，經(jīng)過多輪分離純化，從健康刺參腸道、腐敗海帶及海泥樣品中，共得到32株具有褐藻膠降解能力的菌株(表1)，16S rDNA序列分析顯示大多為弧菌屬(Vibrio)及假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的細菌，此兩類細菌多數(shù)為刺參潛在的條件致病菌[13-14]。在這些菌株中值得關(guān)注的是，通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，在海泥樣本分離得到的菌株有2株屬于水產(chǎn)常用益生菌—芽胞桿菌Bacillussp. WB1及芽胞桿菌Bacillussp. WB2。

表1 褐藻膠降解菌篩選結(jié)果

續(xù)表1

2.2 褐藻膠降解菌株的褐藻膠裂解酶活性

將初篩所得不同菌屬且在褐藻膠選擇性固體平板培養(yǎng)基中長勢較好的菌株進行進一步褐藻膠裂解酶的酶活考察，結(jié)果如圖1所示。其中腐敗海帶樣品中篩選所得菌株溶藻弧菌VibrioalginolyticusWH6具有最高的褐藻膠裂解酶活性，其次是刺參腸道中篩選到的假交替單胞菌屬的細菌Pseudoalteromonassp. WC5，而芽胞桿菌WB1雖然比上述2種刺參潛在條件致病菌的褐藻膠裂解酶活性稍低，但是相比之下更加安全可靠，也具備生產(chǎn)實踐的使用價值，因而初步符合本課題篩選菌株的標準。

圖1 幾種不同來源的菌株褐藻膠裂解酶相對酶活Fig.1 The relative alginate lyase activity of the five strains from different samples

2.3 菌株WB1的生理生化鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

菌株WB1的生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，WB1為革蘭陽性細菌，細胞形態(tài)為桿狀，從生理生化鑒定結(jié)果可以看出菌株WB1具有豐富的蛋白酶及糖苷酶活性，并且其既可利用褐藻膠中的甘露糖醛酸(M)片段也可利用古羅糖醛酸(G)片段作為碳源和能源物質(zhì)進行生長。

基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖3所示，分析表明，與芽胞桿菌WB1同源關(guān)系最近的是在ATCC(美國模式培養(yǎng)物集存庫)保存的標準菌株解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens23842，因此可以認為本實驗中分離得到的菌株WB1是一種解淀粉芽胞桿菌，命名為BacillusamyloliquefaciensWB1。

表2 菌株WB1的生理生化鑒定結(jié)果

注：“+”表明試驗結(jié)果為肯定，“-”表明實驗結(jié)果為否定

2.4 菌株WB1對刺參安全性試驗的結(jié)果

經(jīng)腹腔注射高濃度解淀粉芽胞桿菌WB1菌懸液并觀察14 d后，試驗組刺參狀態(tài)良好，背刺堅挺，貼壁正常，未出現(xiàn)腐皮、潰爛或搖頭等不良反應(yīng)(圖3A與3B)。而陽性對照組在腹腔注射第1天后就出現(xiàn)大規(guī)模吐腸現(xiàn)象，第3天后出現(xiàn)貼壁困難及搖頭癥狀并在隨后的觀察時間內(nèi)逐漸出現(xiàn)腐皮潰爛等癥狀，第8天基本全部死亡(圖3C)。綜上結(jié)果表明，高濃度的解淀粉芽胞桿菌WB1對刺參的生長未表現(xiàn)出潛在致病作用，可以作為刺參安全菌株供下一步試驗使用。

2.5 菌株WB1褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行降解的終產(chǎn)物分析

分子排阻色譜對酶解液中褐藻寡糖聚合度的分析結(jié)果如圖4所示。與不飽和三糖標準品的出峰時間作為對照，可以看出菌株WB1褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行降解的終產(chǎn)物寡糖主要為二糖和三糖，相對含量分別為74.1%和25.9%。利用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測定酶解液中褐藻寡糖平均分子量的結(jié)果如圖5所示。以中國藥品生物制品檢定院的不同分子量右旋糖酐標準品制作標準曲線(圖6)，通過對回歸方程求解，得出酶解液中褐藻寡糖終產(chǎn)物的平均分子量為516 Da。

圖2 基于16S rDNA序列的芽胞桿菌WB1系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis tree of the Bacillus sp. WB1which was obtained by 16S rDNA sequences

圖3 腹腔注射WB1菌液14 d后刺參的生長情況Fig.3 Growth situation of sea cucumbers after 14 d when treated with WB1suspension by intraperitoneal injection

圖4 WB1褐藻膠裂解酶降解褐藻酸終產(chǎn)物的分子排阻色譜Fig.4 Molecular exclusion chromatography of the end-products of degradation of algin by WB1 alginate lyase

圖5 不同分子量右旋糖酐標準曲線Fig.5 Standard curve of dextran with different molecular weight

圖6 WB1褐藻膠裂解酶降解褐藻酸終產(chǎn)物的凝膠色譜Fig.6 Gel chromatography of the end-products of degradation of algin by WB1 alginate lyase

3 討 論

海洋環(huán)境中具有多種可以降解褐藻膠的微生物，這些微生物大多與海洋藻類或軟體動物密切相關(guān)[15-17]，其或者以褐藻多糖作為主要能源物質(zhì)，或者在養(yǎng)分貧乏而褐藻多糖豐富的條件下分泌褐藻多糖裂解酶以對其進行分解利用。從與刺參生長緊密相關(guān)的環(huán)境中篩選菌株是獲得有效、穩(wěn)定且安全的具有褐藻膠降解能力的有益微生物的有效方式。本研究從健康刺參腸道、刺參養(yǎng)殖海域附近的腐敗海帶及海泥中獲取樣本，利用褐藻膠作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，經(jīng)過多輪分離純化，初步篩選出32株具有降解褐藻膠能力的菌株，對其進行了16S rDNA測序分析。通過NCBI網(wǎng)站BLAST相似性比較分析發(fā)現(xiàn)其多為弧菌屬和假交替單胞菌屬的細菌，但其中也分離得到兩株芽胞桿菌屬的細菌。進一步對褐藻膠裂解酶酶活進行比較發(fā)現(xiàn)，與腐敗海帶中篩選得到的能專一降解海帶褐藻膠的溶藻弧菌以及刺參腸道中篩選得到的假交替單胞菌相比，芽胞桿菌褐藻膠裂解酶的活性稍低，但相比具有潛在致病性的弧菌及假交替單胞菌，芽胞桿菌屬的細菌因普遍作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌使用而顯得更加安全可靠[18-19]。

研究表明，芽胞桿菌屬的細菌具有多種益生效果，可作為綠色無害飼料添加劑使用。例如，Rengpipat等[20]以添加芽胞桿菌S11的餌料飼喂斑節(jié)對蝦后期幼體100 d后，以病原菌哈氏弧菌Vibrioharveyi浸浴感染，10 d后所有芽胞桿菌S11處理組的對蝦100%存活，而對照組成活率只有26%；劉克琳等[21]研究認為，芽胞桿菌能顯著促進鯉魚免疫器官的發(fā)育，試驗組鯉魚胸腺的皮質(zhì)增寬、巨噬細胞和粒細胞等表面光滑、絨密集且數(shù)量多；實驗組胸腺T、B淋巴細胞較多、發(fā)育出現(xiàn)分化，T淋巴細胞毛突起少，B淋巴細胞表面突起，絨毛增多。鑒于芽胞桿菌作為常見的益生菌，在降解褐藻膠的同時，可能也會在水體及動物腸道中發(fā)揮一定的益生作用，有利于促進養(yǎng)殖動物的生長發(fā)育及提高抵御病害的能力，因而符合本研究的菌種選擇標準。

對兩株篩選所得芽胞桿菌的褐藻膠裂解酶活性進行比較，菌株WB1具有較高的褐藻膠裂解酶活性。進一步的形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹表明其與ATCC中保存的標準菌株BacillusamyloliquefaciensATCC 23842具有最高的同源性，因此將其鑒定為一種解淀粉芽胞桿菌，命名為BacillusamyloliquefaciensWB1。解淀粉芽胞桿菌是農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)中常用的一種益生菌，其具有α-淀粉酶及蛋白酶等多種消化酶活性，與枯草芽胞桿菌在形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特性方面非常相似[22]。通過TLC及分子排阻色譜分析發(fā)現(xiàn)，WB1的褐藻膠裂解酶對褐藻多糖降解的終產(chǎn)物以二糖為主，也含有少量三糖，因色譜圖中觀察不到單糖的存在，提示W(wǎng)B1的褐藻膠裂解酶可能是一種內(nèi)切酶，這與文獻報道的很多褐藻膠裂解酶都為內(nèi)切酶相符[23]。

雖然很多解淀粉芽胞桿菌都被作為農(nóng)業(yè)或水產(chǎn)中的益生菌使用，但為確保解淀粉芽胞桿菌WB1在生產(chǎn)實踐中對刺參沒有任何潛在致病性，本研究通過腹腔注射攻毒試驗，對解淀粉芽胞桿菌WB1的安全性進行了考察。結(jié)果表明即使用高濃度的WB1菌懸液經(jīng)腹腔注射攻毒，也未對刺參造成任何致病癥狀，這為WB1作為活菌制劑在刺參飼料中的使用提供了安全性保障。

綜上所述，經(jīng)過大量的菌株分離鑒定試驗，解淀粉芽胞桿菌WB1具備良好的褐藻膠降解能力且對刺參沒有任何潛在致病性，因此可作為一種降解海帶飼料原料中褐藻膠的潛在目標菌株使用。

[1] 宋廣軍，王麗梅，李世國，等. 大連沿海野生鼠尾藻種群生態(tài)調(diào)查[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2011，30(9)：528-532.

[2] 劉增勝, 柳正．中國漁業(yè)年鑒[M]．北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010: 6-11.

[3] 唐黎，王吉橋，許重，等. 不同發(fā)育期的幼體和不同規(guī)格刺參消化道中四種消化酶的活性[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2007，26(5)：275-277.

[4] 郭娜，董雙林，劉慧. 幾種飼料原料對刺參幼參生長和體成分的影響[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，2011，32(1)：123-128.

[5] Gacesa P. Alginates[J]. Carbohydpolym，1988, 8(3): 161-182.

[6] Doubet R S, Quatrano R S. Properties of alginate lyases from marine bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1984, 47(4): 699-703.

[7] Boyen C, Bertheau Y, Barbeyron T, et al. Preparation of guluronatelyase fromPseudomonasalginovorafor protoplast isolation inLaminaria[J]. Enzyme Microb Technol，1990, 12(11): 885-890.

[8] Hansen J B, Doubet S, Ram J. Alginase enzyme production byBacilluscirculans[J] .ApplEnviMicrob，1984(4), 47: 704-709.

[9] Martin F, Collen M. Bias in template-to-product ratios in multi-template PCR[J]. ApplMicrobiolBiotechnol，1998, 64(10): 3724-3730.

[10]Altschul S F, Gish W, Miller W, et al. Basic local alignment search tool[J]. J Mol Biol，1990, 215(3): 403-410.

[11]Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res，1997, 25(24): 4876-4882.

[12]Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA-3: integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinform，2004, 5(2): 150-163.

[13]Zhang C Y, Wang Y G, Rong X J. Isolation and identification of causative pathogen for skin ulcerative syndrome inApostichopusjaponicas[J]. J Fish Sci China，2006, 30(1): 118-123.

[14]張瑩，姜國良，劉云，等. 仿刺參“腐皮綜合癥”病灶處優(yōu)勢菌的分離鑒定及AHLs信號分子的檢測[J]. 微生物學(xué)通報，2009，36(11)：1664-1669.

[15]Sutherland I W, Keen G A. Alginases fromBeneckeapelagiaandPseudomonasspp.[J].J ApplBiochem，1981, 3: 48-57.

[16]Riesen V L. Digestion of align byPseudomonasmaltophiliaandPseudomonasputida[J].Appl Environ Microbiol,1980, 39(1): 92-96.

[17]Tseng C H, Yamaguchi K, Kitamikado M. Isolation and some properties of alginate lyase from a marine bacteriumVibriosp. AL-128[J]. Nippon Suisan Gakk,1992, 58(3): 533-538.

[18]José L B, Ignacio B, Imanol R Z, et al. The role of probiotics in aquaculture[J]. Vet Microbiol,2006, 114(3-4): 173-186．

[19]Irianto A, Austin B. Probiotics in aquaculture[J]. J Fish Dis,2002, 25(11): 633-642.

[20]Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, et al. Effect of a probiotic bacterium on black tiger shrimpPenaeusmonodonsurvival and growth[J]. Aquaculture,1998, 167(3-4): 301-313.

[21]富麗靜，王雷，宋文華. 復(fù)合微生物在高密度主養(yǎng)鯽池塘中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科學(xué),2002，21(1)：23-25.

[22]張娟，楊彩梅，曹廣添，等. 解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應(yīng)用[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報,2014，26(4)：1-4.

[23]Thiang Y W, Lori A P, Neal L S. Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications[J]. Annu Rev Microbiol,2000, 54(31): 289-340.

歡 迎 投 稿 歡 迎 訂 閱

Isolation and Identification of Algin-Degrading Bacteria in Kelp (Laminariajaponica) Forage Materials for Spiny Sea Cucumber (ApostichopusJaponicas)

WANG Xi-tao1, 2, LI Shu-ying2, WANG Li-li3, LI Xiao-yu3, XU Yong-ping1, 2, 3

(1.SafetyGuarant.Technol.ofAnim.Food,Engin.Res.Ctr.,Dalian116620; 2.DalianSaimuBio-Technol.Co.Ltd.,Dalian116620; 3.Coll.ofLifeSci. &Technol.DalianUni.ofSci. &Technol.Dalian116024)

An impathogenic microbe that can effectively degrade algin was screened and isolated from kelp and the sea cucumber culturing environment. Using the microbe for degrading and treating kelp forage materials could decrease the algin component that is difficult to digest by spiny sea cucumber (A.japonicas) and increase the utility ratio and the value of kelp forage material. The culture medium with sodium alginate as the sole carbon source was used for preliminary screening; DNS method was used to determine the activity of alginate lyase; 16S rDNA sequencing and physiological and biochemical tests were carried out to characterize the experimental bacterial strain; The strain was investigated by injecting the sea cucumber with a high dose of the bacterial suspension at the coelom to test the toxicity of the microbe for the potential pathogenicity; The end-product of alginate lyase digestion of algin by the strain was analyzed with the method of molecular exclusion chromatography and high gel permeation chromatography. The results showed that the strain WB1 had the highest homology withBacillusamyloliquefaciens, and had no pathogenicity against spiny sea cucumber, the end products of its algin lysis by lyase mainly were disaccharide and trisaccharide with relative contents at 74.1% and 25.9% respectively, and average molecular weight at 516 Da. Therefore, the strainB.amyloliquefaciensWB1 can be used as safety, beneficial microbe to lysate the algin component in spiny sea cucumber forage.

spiny sea cucumber (Apostichopusjaponicas);Bacillusamyloliquefaciens; kelp (Laminariajaponica); algin

國家海洋公益項目(201405003)

王熙濤 男，博士后。主要研究方向為益生菌及微生態(tài)制劑做為綠色飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。

E-mail：wxt731@sina.com

2016-01-16；

2016-03-25

Q93-331

A

1005-7021(2016)06-0061-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.010

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向為噬菌體、益生菌、卵黃免疫球蛋白(IgY)、天然植物活性成分等新型綠色

技術(shù)控制動物細菌及病毒性疾病以替代抗生素的研究。E-mail：sembio@126.com