閆曉雪, 時小東, 張國珍, 秦小波*,寧 華, 陳 放, 陳惠群, 劉洪玉

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,四川 成都 610064；2.四川省自然資源科學(xué)研究院 生物技術(shù)中心,四川 成都 610015)

西南地區(qū)部分野生羊肚菌ITS序列鑒定及生境分析

閆曉雪1, 2, 時小東1, 2, 張國珍2, 秦小波2*,寧 華2, 陳 放1, 陳惠群2, 劉洪玉2

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,四川 成都 610064；2.四川省自然資源科學(xué)研究院 生物技術(shù)中心,四川 成都 610015)

分析了川渝7個縣(/區(qū))18個位點野生羊肚菌的生態(tài)環(huán)境；同時對羊肚菌的品種進(jìn)行鑒定。運用SPSS對各位點野生羊肚菌的生態(tài)環(huán)境相關(guān)數(shù)據(jù)(包括海拔、生長環(huán)境、土壤物理指標(biāo)和有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷等化學(xué)成分)進(jìn)行因子分析。采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，結(jié)合觀察特征，鑒定各位點羊肚菌品種。各位點樣品PCR 擴(kuò)增所得片段大小約為1 200～1 800 bp，經(jīng)過測序及BLAST 分析，18個位點羊肚菌品種集中為羊肚菌(Morchellaesculenta)、尖頂羊肚菌(Morchellaconica)、小羊肚菌(Morchelladeliciosa)等7個種類，與根據(jù)形態(tài)命名方式得到的結(jié)果差距較大；其生境中關(guān)鍵因子為有機(jī)質(zhì)，范圍為0.55%～2.60%；其次是磷元素和含水量。西南地區(qū)野生羊肚菌生境相似度較高，品種較為集中，為西南地區(qū)羊肚菌野生資源研究和人工栽培提供了參考依據(jù)。

西南；野生羊肚菌；ITS序列；生態(tài)環(huán)境

羊肚菌是子囊菌亞門(Ascomycota)羊肚菌屬(Morchella)的統(tǒng)稱，因其子實體菌蓋具有皺似羊肚的不規(guī)則凹凸褶而得名[1]。羊肚菌營養(yǎng)價值豐富，具有抗癌、提神、抗氧化等多種功效[2-4]，作為名貴的食藥兼用菌享譽(yù)世界。其分布廣泛，種類繁多，在世界許多區(qū)域均有分布[5]。我國西南一帶野生羊肚菌資源非常豐富，且在大田人工栽培技術(shù)方面取得了突破性進(jìn)展[6-7]。野生菌形態(tài)易受子實體發(fā)育階段和生長環(huán)境等因素的影響，給其鑒定帶來巨大困難，加之許多野生菌形態(tài)極為相似，更增加了鑒定難度。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)的方法在食用菌鑒定中得到廣泛應(yīng)用[8]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)為中度保守序列，在種內(nèi)相對一致，種間差異較明顯[9]。同時具有快速、準(zhǔn)確和簡便等優(yōu)點，在植物[10]、藻類[11-12]和真菌[13-14]鑒定中得以應(yīng)用?；贗TS序列的真菌鑒定和親緣關(guān)系研究在羊肚菌研究中也得到了相應(yīng)應(yīng)用[15]，也有研究用ITS序列將羊肚菌劃分為黃色、黑色和變紅羊肚菌支系三個支系[11]。目前人工羊肚菌栽培技術(shù)尚未成熟，現(xiàn)有產(chǎn)量難以滿足市場對羊肚菌的需求[16]。同時在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，野生羊肚菌資源的大量采集也造成種質(zhì)資源不斷減少[17]。對羊肚菌生態(tài)環(huán)境、生理過程和遺傳機(jī)制等知識的缺乏，嚴(yán)重制約了羊肚菌商業(yè)化栽培技術(shù)的進(jìn)程[18]。因此對野生羊肚菌優(yōu)良品種篩選及生長條件進(jìn)行深入分析，突破羊肚菌人工栽培的瓶頸，將為羊肚菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

18個位點羊肚菌材料主要于2014至2015年采集自四川和重慶，整株采集后存放于收集袋中，帶回實驗室常溫保存。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 根據(jù)子實體菌蓋和菌柄的著生情況、顏色、形狀，以及凹陷狀態(tài)等信息進(jìn)行傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)檢測 每個采集地選取羊肚菌子實體周邊(10 cm直徑范圍內(nèi))土壤，測定其理化指標(biāo)，方法參見 NY/T 52-1987、Y/T 1121.2-2006、NY/T 1121.6-2006、NY/T 53-1987、GB/T 9837-1988、NY/T 88-1988。土壤電導(dǎo)率E.C 參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)常規(guī)分析方法》第4版，中國環(huán)境科學(xué)出版社。

1.2.3 菌蓋DNA提取 采用全基因組試劑盒提取菌蓋基因組DNA，試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.4 序列擴(kuò)增及檢測 參照ITS序列擴(kuò)增方法[19]，PCR引物序列[ITS1(TCCGTAGGTGAA-CCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)]由華大科技合成；PCR體系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix (Vazyme) 25 μL，引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊50 μL；PCR程序：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性60 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的條帶回收，送華大科技測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 序列對比采用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序完成，并用MEGA進(jìn)行對比分析，根據(jù)鄰近遺傳距離法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對結(jié)果進(jìn)行分類[20-21]；其他數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS分析完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌發(fā)生地生態(tài)環(huán)境

18個位點羊肚菌采集自7個縣/區(qū)，具體信息見表1。從生態(tài)環(huán)境看，羊肚菌采集地多為苔蘚、草叢或落葉中，能夠避免長時間陽光照射，增加了發(fā)生地的濕度和腐殖土厚度。發(fā)生區(qū)對坡向和坡度要求不是很高，海拔分布范圍較廣，從247.9 m到2 387.3 m均有分布，說明羊肚菌海拔分布范圍廣，適應(yīng)能力較好，這可能取決于羊肚菌品種的多樣性，同時也說明各生態(tài)因子不是單獨作用，而是共同維持羊肚菌菌絲生長和子實體發(fā)生等生命周期的各個階段。

表1 羊肚菌樣品來源、形態(tài)及分子鑒定結(jié)果

2.2 土壤理化性質(zhì)初步分析

土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷的測定結(jié)果見表2。由表2可知，18個位點羊肚菌采集地土壤含水量范圍為54.00%～70.00%，M株(表1中編號13株)采集地含水量最?。话l(fā)生地土壤呈弱酸性，pH值在5.80～7.00左右，其中編號M株和N株(編號15株)采集地土壤酸堿度分別最大和最?。话凑談澐謽?biāo)準(zhǔn)，18個位點土壤有機(jī)質(zhì)含量屬于中等肥力類型，含量在0.55%～2.60%；總氮和總磷含量范圍分別為0.01%～0.39%和0.02%～0.12%。

運用SPSS對土壤理化值進(jìn)行描述(表2)，由結(jié)果可知，18個位點羊肚菌發(fā)生地土壤含水量和pH平均值分別為59.54和6.45，P值在可信任范圍，說明羊肚菌發(fā)生地之間土壤含水量和酸堿度之間均有顯著性差異，但含水量偏差較大(標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.12)，pH在6.45符合羊肚菌生長環(huán)境，有利于羊肚菌菌絲的生長和子實體的出現(xiàn)；如果pH太高或太低，羊肚菌子實體則不會發(fā)生。就土壤營養(yǎng)成分而言，有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷和總鉀是其土壤組成的最主要成分，18個位點檢測的土壤營養(yǎng)成分之間均存在顯著差異?？偭缀涂偟獦?biāo)準(zhǔn)偏差較小，總鉀的差異變化較大，而氮元素的含量決定了土壤腐殖質(zhì)的含量。

表2 羊肚菌樣品生境因子的統(tǒng)計信息

注：E.C為土壤電導(dǎo)率，下同

2.3 土壤理化性質(zhì)主成分分析

Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)檢驗和Bartletts’s球形檢驗是用于分析變量間的相關(guān)系數(shù)和偏相關(guān)系數(shù)，以及變量間獨立性的指標(biāo)，以便后續(xù)判斷是否適合進(jìn)行變量主成分分析。對18個位點野生羊肚菌土壤成分進(jìn)行KMO和Bartlett’s檢驗(表3)，KMO值為0.505，大于0.5，表明變量間具有相關(guān)性，可以進(jìn)行后續(xù)相關(guān)性分析。另外，Bartlett’s球形檢驗值(91.268)顯著性Sig.為0.000，達(dá)到了顯著水平，說明土壤成分間存在共性，并非獨立，進(jìn)一步證明了18個位點野生羊肚菌土壤成分元素間可運用主成分分析法進(jìn)行分析。

表3 18個位點野生羊肚菌土壤成分的KMO與Bartalett’s 檢驗

主成分分析可以解釋事物本質(zhì)間的聯(lián)系，其重要指標(biāo)為特征根和方差貢獻(xiàn)率，由表4可知，各主成分間載荷系數(shù)相差不大，不易對各成分進(jìn)行明確，因此需要進(jìn)行因子載荷矩陣的旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)后各載荷系數(shù)見表5(采用方差最大化旋轉(zhuǎn))。由表5可知，旋轉(zhuǎn)后各系數(shù)發(fā)生了明顯極化，第一成分中起主要作用的是有機(jī)質(zhì)，第二主成分中表現(xiàn)出與總磷高度的正相關(guān)，第三成分中含水量起主要作用。通過羊肚菌土壤理化性質(zhì)的主成分分析，可以初步判斷有機(jī)質(zhì)、磷元素和含水量在羊肚菌發(fā)生中的重要性。

表4 各變量在主成分中的載荷系數(shù)

表5 旋轉(zhuǎn)后各原始變量對主成分的載荷表

2.4 基于形態(tài)的鑒定

對18個位點野生羊肚菌子實體進(jìn)行拍照記錄，并對所有菌株進(jìn)行命名。其中編號2、3、5、10、13和14命名為粗柄羊肚菌(Morchellacrassipes)，其子實體大小為中型；菌蓋淺黃色，表面凹坑不規(guī)則或近圓形；菌柄白色，粗壯，基部有膨脹變大現(xiàn)象發(fā)生。編號1和9 命名為羊肚菌(Morchellaesculenta)，其子實體中等大小，頂端無明顯尖端，較鈍；菌蓋凹坑較多，淡黃色；菌柄較粗，白色或近白色。編號6、7和8 命名為小羊肚菌(Morchelladeliciosa)，其子實體較??；菌蓋淺褐色，表面凹坑較深，脈棱多縱向排列；菌柄較短，近白色或淺褐色。其余菌株則根據(jù)形態(tài)分別命名，編號4、17和18為梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)，編號11和12為七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)，編號15和16為普通羊肚菌(Morchellavulgaris)。

2.5 ITS序列及分析

運用分子生物學(xué)方法采用ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段的長度約為1 200～1 800 bp。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，由表1可知，18個位點羊肚菌在分類中均屬羊肚菌科羊肚菌屬，其中1、2、5、6、9和10為Morchellaesculenta；11、12、17和18為Morchellaconica； 其余8個編號對應(yīng)4個種類，而這一結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果存在差別(表1)。

結(jié)合運用NJ法系統(tǒng)樹分析，依據(jù)ITS序列將羊肚菌分為黑羊肚菌、黃羊肚菌和變紅羊肚菌等3個支系[22-24]，本研究中的18個位點野生羊肚菌，主要為黃色羊肚菌支系，包含11株，其次是黑色羊肚菌支系，包含7株，未發(fā)現(xiàn)紅色羊肚菌支系(圖1)。

圖1 18個樣品的系統(tǒng)樹分析(NJ法)Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 18 samples (NJ Method)

3 討 論

羊肚菌分布廣泛，在世界許多地域均有分布[5]。我國幅員遼闊，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，羊肚菌資源豐富，在云南、四川、重慶、河南、河北、黑龍江、遼寧、新疆、江蘇等地均有羊肚菌資源報道[6]。本研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)查區(qū)域內(nèi)羊肚菌的種類較為集中，這可能與地理氣候環(huán)境有關(guān)。對野生羊肚菌資源進(jìn)行調(diào)查，生物學(xué)功效的深入分析，以及優(yōu)質(zhì)品種的篩選，這將為更好地實現(xiàn)羊肚菌菌種的選育改良及高效人工栽培提供途徑。

本研究從形態(tài)上鑒定為粗柄羊肚菌的2、5和10號樣品，經(jīng)ITS分析發(fā)現(xiàn)為羊肚菌；而形態(tài)鑒定的11、12號七妹羊肚菌和17、18號梯棱羊肚菌，經(jīng)ITS分析發(fā)現(xiàn)為尖頂羊肚菌。前者可能因為子實體生長中生境營養(yǎng)供應(yīng)的斷層導(dǎo)致形態(tài)更趨于粗柄羊肚菌；而后者可能由于子實體發(fā)育時光照影響了形態(tài)建成所致?？傊?，結(jié)合形態(tài)和分子鑒定更有利于比較分析鑒定羊肚菌。目前，世界上羊肚菌亞種和變種共有313個[18]，利用形態(tài)對眾多羊肚菌種類進(jìn)行鑒定的難度較大。利用分子手段，特別是依據(jù)ITS序列進(jìn)行真菌鑒定已應(yīng)用較多[25]，同時新一代測序技術(shù)的應(yīng)用和數(shù)據(jù)挖掘為羊肚菌的命名和鑒定提供了可靠的依據(jù)，可有效解決羊肚菌界定的難題和避免同種異名或異種同名的現(xiàn)象發(fā)生[1]。

本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)查的野生羊肚菌生境中的有機(jī)質(zhì)較為豐富，這符合食用菌對有機(jī)質(zhì)的需求；同時生境中含水量也對羊肚菌較為重要。野生羊肚菌菌絲生長和子實體的營養(yǎng)環(huán)境，以及人工栽培過程中的培養(yǎng)特性研究，一直是羊肚菌研究的難點之一。關(guān)于菌絲和菌核營養(yǎng)環(huán)境的研究較多，已經(jīng)取得了大量的數(shù)據(jù)[26]。目前，碳源、氮源、無機(jī)離子、生長因子，以及溫度、酸堿度、濕度和光照等野外調(diào)查數(shù)據(jù)較少；關(guān)于羊肚菌子實體發(fā)生的營養(yǎng)環(huán)境的調(diào)查也不多，僅有少量報道[27-30]。因此，羊肚菌的規(guī)?；斯ぴ耘嘁廊贿M(jìn)程緩慢；羊肚菌生長營養(yǎng)條件的數(shù)據(jù)挖掘，各因素之間的關(guān)聯(lián)分析，以及羊肚菌不同生長階段對營養(yǎng)元素需求的差異研究尤為重要，將為羊肚菌不同生長周期營養(yǎng)的補(bǔ)給和環(huán)境的改良提供理論基礎(chǔ)。

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Analysis of WildMorchellaITS Sequence Identification & Habitat in Part of SW China

YAN Xiao-xue1, 2, SHI Xiao-dong1, 2, ZHANG Guo-zhen2, QIN Xiao-bo2, NING Hua2,CHEN Fang1, CHEN Hui-qun2, LIU Hong-yu2

(1.KeyLab.ofBio-Res. &Eco-Environm't,Minist.ofEduc.,Coll.ofLifeSci.,SichuanUni.,Chengdu610064; 2.Bio-TechCtr.,SichuanNat.Res.Inst.,Chengdu610015)

The ecological environment of wildMorchellafrom 18 sites’ in 7 counties of Sichuan and Chongqing was investigated, at the same time theMorchellaspecies were identified. The related data of ecological environment, including altitude, growth environment, soil physical indicators, organic matter, total nitrogen and total phosphorus were carried out factor analysis using SPSS. Each Morchella species sample of the sites was identified by the internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis, combined with the characteristics observation ofMorchellaspecies. The ITS result indicated that the length of PCR fragments from each site’s samples collected was 1 200-1 800 bp and the 18 samples were similar to 7 kinds ofM.esculenta,M.conica,M.deliciosaetc through sequencing and BLAST analyses. There is a fairly large gap as compared with the result ofMorchellaclassified by morphological nomenclature. The key factors in the habitat were organic substances that ranged from 0.55% to 2.60%, followed by phosphorus and moisture content. The habitat similarity of wildMorchellain SW China is fairly high, and their variety is relatively concentrated. This study provides a reference foundation for artificial cultivation and the research of wildMorchellaresources in SW China.

SW China; wildMorchell; ITS sequences; ecological environment

四川省科技計劃院所科研項目 (2016YSKY0022)；四川省科技計劃項目(2017NZ0030，2017SZ0162)；成都市科技計劃

閆曉雪 女，碩士研究生。研究方向為食品生物安全。E-mail: scu_0003@163.com

* 通訊作者。男，副研究員，博士。研究方向為植物與微生物資源。Tel: 028-68107840，E-mail: qxb_2003@163.com

2015-12-30；

2016-01-26

Q939

A

1005-7021(2016)06-0048-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.008

項目(2015-CP03-00480-NC)；成都市科技項目(2015-NY02-00001-NC)