李桂瀾， 胥傳來

（1.北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京100871；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

PCR產(chǎn)物的高通量測(cè)序方法及優(yōu)化

李桂瀾1， 胥傳來2

（1.北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京100871；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

PCR產(chǎn)物的高通量測(cè)序被廣泛應(yīng)用于功能基因篩選、腫瘤相關(guān)基因的突變和甲基化檢測(cè)等。在高通量測(cè)序技術(shù)中，建庫(kù)和上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)一直是決定最終DNA數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵。作者優(yōu)化了PCR產(chǎn)物樣品的DNA文庫(kù)制備條件和體系，設(shè)計(jì)了適合PCR產(chǎn)物特點(diǎn)上機(jī)測(cè)序方法，將已建庫(kù)的PCR樣品中混入一定量的基因組標(biāo)準(zhǔn)品后再上機(jī)測(cè)序，由此保證了測(cè)序數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和低冗余度。為低多樣性DNA樣品高通量測(cè)序技術(shù)方法運(yùn)用提供方法上的參考。

PCR產(chǎn)物；高通量測(cè)序技術(shù)；樣品文庫(kù)制備；上機(jī)測(cè)序

DNA測(cè)序是常用的分子生物學(xué)研究技術(shù)，通過測(cè)序分析能提供最真實(shí)可靠的基因序列信息。從1977年第一代傳統(tǒng) DNA雙脫氧鏈末端終止的sanger測(cè)序法問世以來，DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了快速發(fā)展[1-2]?，F(xiàn)在基于邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis）為主的第二代高通量測(cè)序技術(shù)逐漸被廣泛運(yùn)用于基礎(chǔ)研究、臨床醫(yī)學(xué)診斷和腸道微生物群與營(yíng)養(yǎng)及代謝研究領(lǐng)域[2-5]。二代測(cè)序以單個(gè)讀長(zhǎng)較短、通量大為特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組細(xì)致全貌分析，也被稱為深度測(cè)序或高通量測(cè)序[6]。二代測(cè)序研究平臺(tái)從最初Roche公司的454焦磷酸測(cè)序和Illumina公司早先的Solexa測(cè)序技術(shù)發(fā)展到目前廣泛使用的Hiseq、Miseq系列，和Life Technoloiges的Ion PGM和Ion Proton的測(cè)序，測(cè)序技術(shù)無論從速度和通量上得到了前所未有的發(fā)展[7]。目前以Illumina為技術(shù)平臺(tái)的Hiseq X 5系統(tǒng)、Hiseq3000/4000最新的測(cè)序儀器也相繼發(fā)布，使二代測(cè)序樣品建庫(kù)更加高效，讀長(zhǎng)（reads）更長(zhǎng)，通量更高。

PCR產(chǎn)物測(cè)序通過設(shè)計(jì)恰當(dāng)引物探針，運(yùn)用各種PCR技術(shù)將待測(cè)序的目的基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序[8-10]。PCR產(chǎn)物的高通量測(cè)序技術(shù)被輔助運(yùn)用于細(xì)胞文庫(kù)中功能基因的篩選，腫瘤相關(guān)基因突變及甲基化檢測(cè)和微生物菌群的營(yíng)養(yǎng)及代謝相關(guān)探索研究[11-12]。以Illumina為平臺(tái)的高通量測(cè)序，對(duì)片段大小在150~350 bp的PCR混合物樣品，與基因組 DNA和微量的 ChIP-seq（Chromatin Immuno Precipitation，ChIP）樣品的文庫(kù)制備方法不同[13-14]。雖然目前建庫(kù)技術(shù)整體一直在被優(yōu)化，測(cè)序通量和測(cè)序長(zhǎng)度也在不斷的進(jìn)行技術(shù)革新使之達(dá)到更高的測(cè)序要求，但I(xiàn)llumina的邊合成邊測(cè)序技術(shù)核心仍無法改變，也決定了Illumina二代測(cè)序的技術(shù)局限性。所以根據(jù)PCR產(chǎn)物樣品自身的特點(diǎn)，文庫(kù)制備和上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)都需要進(jìn)行特別的設(shè)計(jì)和處理。作者主要以Illumina系列的二代測(cè)序平臺(tái)，在普通的ChIP建庫(kù)方法，基于片段已知的DNA樣品通過兩步末端修飾反應(yīng)后加DNA通用接頭的實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)建立了一種適合PCR混合物樣品性質(zhì)特點(diǎn)的文庫(kù)制備及上機(jī)操作實(shí)驗(yàn)，以確保高效低成本的建庫(kù)技術(shù)及上機(jī)測(cè)序中得到最佳的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量。作者以Illumina為代表的高通量測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)及具體實(shí)驗(yàn)方法，為不同的研究領(lǐng)域中選擇不同測(cè)序方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 ChIP-Seq Sample Prep Master Mix試劑盒：美國(guó) New England Biolabs公司；NEBNext Multiplex Oligos；Agencourt AMPure XP的 DNA純化磁珠：美國(guó)BECKMAN COULTER公司；Brilliant SYBR Green QPCR試劑盒：美國(guó)Agilent公司；上機(jī)雙端測(cè)序試劑 Miseq Reagent Kit V3 （2×150 cycles）： 美國(guó) Illumina公司；100 bp plus DNA Marker相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：北京全式金生物技術(shù)公司；100%乙醇、Tris、Tween20和 NaOH：美國(guó)Sigma公司。1.5 mL低DNA吸附（LoBind）微量離心管：美國(guó)Eppendorf。

1.1.2 DNA分子 New England Biolabs公司提供：接頭分子（Adaptor）：5’-pGATCGGAAGAGCACACG TCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3’；上游引物：5’-AATG ATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA CACGACGCTCTTCCGATCT-3’；下游引物：5’-CAA GCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTG GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；下游引物中的下劃線加粗的6個(gè)堿基為第10號(hào)標(biāo)簽（index）DNA分子。Takara合成熒光定量PCR引物：上游引物P1：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’；下游引物P2：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG A-3’。

1.2 儀器

Miseq第二代高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；美國(guó)Bio-Rad核酸電泳儀、凝膠成像儀和PCR核酸擴(kuò)增儀；電子天平和pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Scientific公司；Qubit 2.0熒光定量?jī)x：美國(guó)Life Technologies公司；Mx300P熒光定量PCR儀：美國(guó)安捷倫公司；Fragment Analyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑：美國(guó)Advanced Analytical。ThermoMixer恒溫混勻儀：美國(guó)Eppendorf。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)序樣品文庫(kù)制備 切膠純化回收后的PCR產(chǎn)物樣品T1、T2和T3，瓊脂糖凝膠電泳圖中條帶是分布在200~300 bp寬峰，見圖1。用NanoDrop2000測(cè)定質(zhì)量濃度分別為24.2、25.2、26.2 ng/μL；A260/A280的OD值為1.68、1.59和1.76。

建庫(kù)的初始樣品用 Qubit 2.0熒光定量?jī)x對(duì)PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)確定量后各取2 μL（DNA總量在10~50 ng）于1.5 mL的Lobind離心管，準(zhǔn)備第一步的平末端修復(fù)反應(yīng)：1 μL末端修復(fù)反應(yīng)聚合酶和5μL的10×末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液，用RNase free H2O補(bǔ)足至反應(yīng)終體積50 μL，恒溫混勻儀中30℃反應(yīng)20 min。 結(jié)束后加入80 uL的AMPure XP磁珠純化反應(yīng)后樣品，用44 uL RNase free H2O洗脫。第二步直接向樣品溶液加入1 μL Klenow片段酶和5 μL的10×反應(yīng)緩沖液（含0.2 mmol/L dATP），在37℃反應(yīng)30 min，完成末端加“A”修飾反應(yīng)。同樣用80 μL磁珠純化，19 μL的RNase free H2O洗脫。

圖1 二代測(cè)序的PCR產(chǎn)物樣品T1-T3Fig.1 PCR products T1-T3 for next-generation sequencing

將DNA接頭分子稀釋到5 μmol/L后取1 μL到樣品溶液中準(zhǔn)備連接反應(yīng)，加6 μL的5×快速連接緩沖液和4 μL的快速DNA連接酶，小心混勻，室溫25℃靜置孵育15 min。結(jié)束后加入試劑盒的USER酶2 μL，在37℃反應(yīng)15 min完成接頭開環(huán)剪切。最后用與樣品等倍體積30 μL的磁珠純化兩遍，檢測(cè)濃度。取10 μL（總量在5~10 ng）樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，循環(huán)數(shù)減少至15次。最后用與樣品等體積的磁珠純化兩遍，30 μL的ddH2O洗脫，檢測(cè)濃度。

1.3.2 建庫(kù)后樣品質(zhì)量檢控 將建庫(kù)后樣品稀釋至0.5~2 ng/μL，分別用Fragment Analyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行片段分析；用Mx300Ps熒光定量PCR儀對(duì)樣品進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。選用的標(biāo)準(zhǔn)品為已準(zhǔn)確定量并上機(jī)測(cè)序后的建庫(kù)樣品。用10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.05%Tween 20緩沖液按10倍梯度配制成0.002~20 pmol/L五個(gè)不同濃度以獲得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。建庫(kù)樣品再次稀釋 104倍到 0.1~ 2 pmol/L后取2 μL，2×Brilliant SYBR Green Master Mix 5 μL，10 μmol/L引物P1/P2 Mix 0.4 μL，最后ddH2O補(bǔ)足為10 μL的反應(yīng)體系，陰性對(duì)照組NTC（No Template Control）和所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)品做三組重復(fù)。

[Final Conc（nmol/L）]=[QPCR]×340×104×10-6/Fragm

式中，[QPCR]代表儀器根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)出來的平均樣品濃度 （fM）；340 bp代表選用的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的片段大??；104代表樣品稀釋倍數(shù)；Fragm代表建庫(kù)后樣品的平均片段大小。

1.3.3 Illumina Miseq上機(jī)測(cè)序 對(duì)已建庫(kù)樣品T2準(zhǔn)備上機(jī)測(cè)序，將T2樣品與Phix基因組標(biāo)準(zhǔn)樣品等摩爾混合，用10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液稀釋至終濃度2 nmol/L，取10 μL的上機(jī)混合樣品，加入10 μL 2 mol/L的NaOH充分混勻后室溫變性5 min。用雙端測(cè)序試劑盒里的雜交緩沖液將樣品稀釋到18 pmol/L，取600 μL上機(jī)測(cè)序。Illumina數(shù)據(jù)收集和分析軟件：Miseq Control Software；Real Time Analysis（RTA）；Offline Basecaller（OLB）；CASAVA軟件用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建庫(kù)后樣品檢測(cè)

PCR產(chǎn)物樣品T1，T2和T3為同一樣本的3個(gè)平行生物組重復(fù)。建庫(kù)結(jié)束后檢測(cè)終質(zhì)量濃度為：22.2、15.3、16.1 ng/μL各30 μL體系。隨機(jī)選取樣品T2的建庫(kù)及上機(jī)測(cè)序結(jié)果分析。用 Fragment Analyzer分析初始樣品和建庫(kù)后樣品片段分布，見圖2-3。樣品建庫(kù)后片段的出峰位置出現(xiàn)移動(dòng)，增加約120 bp，滿足接頭序列成功連接后的片段分布情況。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所得的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)為Rsq：99.9%，計(jì)算得到稀釋后的3個(gè)建庫(kù)樣品濃度12.46、6.78、7.81 nmol/L，滿足上機(jī)測(cè)序要求。T2樣品準(zhǔn)備上機(jī)測(cè)序。

圖2 高通量測(cè)序樣品T2的DNA片段分析Fig.2 DNA fragment analysis of sample T2

圖3 測(cè)序樣品T2建庫(kù)后的DNA片段分析Fig.3 DNA fragment analysis of final library sample T2

2.2 上機(jī)測(cè)序結(jié)果

Illumina Miseq測(cè)序中最主要指標(biāo)參數(shù)是數(shù)據(jù)質(zhì)量Q30值和測(cè)序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4-5。其中百分比≥Q30代表每輪測(cè)序堿基的質(zhì)量不低于99.9%所占的百分比。統(tǒng)計(jì)T2樣品測(cè)序最終的Q值分布（橫坐標(biāo)）和得到的數(shù)據(jù)量（縱坐標(biāo)，單位是million）。統(tǒng)計(jì)得到全部測(cè)序總數(shù)據(jù)量為5.8G，數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30的占94.3%。最終統(tǒng)計(jì)得到的T2樣品原始測(cè)序數(shù)據(jù)量（Raw Data）為3.725 G。進(jìn)一步生物信息過濾處理得有效可用數(shù)據(jù)（clean data）為3.705 G，數(shù)據(jù)有效率為99.46%，Q20值為94.09%，Q30值為92.85%；GC含量比例為48.19%。結(jié)果滿足后續(xù)對(duì)T2測(cè)序樣品的生物學(xué)研究分析的基本要求。

圖4 樣品T2在Miseq上機(jī)測(cè)序得到的全部數(shù)據(jù)Q值（Quality Score）分布統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistic of the QScore distribution on illumina Miseq

圖5 Hiseq2000的測(cè)序芯片 （flowcell）中第4條測(cè)序通道（lane 4）里所有樣品都只是PCR產(chǎn)物樣品測(cè)序時(shí)的數(shù)據(jù)Q30分布統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistic of the Qscore distribution without the phix standard mixture on lane 4 at Hiseq 2000

2.3 上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)優(yōu)化分析

當(dāng)前二代高通量測(cè)序正突飛猛進(jìn)地不斷進(jìn)行技術(shù)革新，但以Illumina為平臺(tái)的邊合成邊測(cè)序的核心技術(shù)原理保持不變[2]。在上機(jī)測(cè)序過程中前25個(gè)堿基測(cè)序循環(huán)（cycle）結(jié)果質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)方法無法改變，依舊決定了整個(gè)測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。測(cè)序中監(jiān)測(cè)參數(shù)Cluster PF（Pass Filter）仍是重要的上機(jī)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)測(cè)序的前25個(gè)堿基低質(zhì)量的數(shù)據(jù)有兩個(gè)以上（即PF＜60%），測(cè)序儀器將判定這條讀長(zhǎng)質(zhì)檢不通過。而PCR產(chǎn)物樣品DNA多樣性差，在測(cè)序中極易引起兩個(gè)堿基的識(shí)別可靠性低于60%，從而減損最終測(cè)序的Q30值和判定合格測(cè)序數(shù)據(jù)總量，見圖6。圖4為Illumina Hiseq2000測(cè)序中的第5測(cè)序通道（Lane 5）標(biāo)準(zhǔn)基因組樣品測(cè)序監(jiān)測(cè)的%Base正常分布情況，Cluster PF（%）為95.23±1.15，可獲得的數(shù)據(jù)量約34 G；圖7為同時(shí)測(cè)序中第4通道（Lane 4）的樣品當(dāng)全為PCR產(chǎn)物時(shí)%Base分布情況，Cluster PF（%）為21.24±14.83。使最終得到的合格數(shù)據(jù)量和Q30的統(tǒng)計(jì)值降低，測(cè)序通道Lane 4里全部測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30僅為52.9%，最終獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)量降低到4.5 G。

作者嘗試將待測(cè)的PCR產(chǎn)物樣品T2中混合了等摩爾的Phix基因組標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行Miseq測(cè)序，監(jiān)測(cè)得到的Cluster PF（%）為89.81±0.72。最終目的樣品T2占整個(gè)有效測(cè)序數(shù)據(jù)量的61.77%，大大改善了PCR混合物測(cè)序樣品的數(shù)據(jù)質(zhì)量和有效數(shù)據(jù)總量。對(duì)于多樣性差的其它待測(cè)序DNA樣品，比如RRBS 樣 品 （Reduced Representation Bisulfite Sequencing，簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸氫鹽測(cè)序），由于含有固定的酶切位點(diǎn)序列降低了樣品的多樣性，但通過混入一定量比例的多樣性好的基因組標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示得到的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可提高約50%。

圖6 在Illumina Hiseq2000測(cè)序儀器中監(jiān)測(cè)的第5條測(cè)序通道標(biāo)準(zhǔn)基因組樣品的堿基分布圖Fig.6 Base distribution of genomic DNA sequencing on lane 5 of Illumina Hiseq 2000

目前還可以嘗試降低待測(cè)序樣品上樣量的方法改善低多樣性樣品引起的低數(shù)據(jù)質(zhì)量的情況。但研究表明至少要降低一半的PCR樣品量才可能達(dá)到略微的效果，也大大折損了測(cè)序數(shù)據(jù)總量，并非經(jīng)濟(jì)有效的方案。而選擇將多樣性好的基因組樣品摻入到多樣性差的樣品中上機(jī)測(cè)序的方法，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，能改善整個(gè)測(cè)序通道的樣品多樣性表現(xiàn)，從而提高測(cè)序質(zhì)量，同時(shí)也能保證得到的最終有效的測(cè)序數(shù)據(jù)總量損失最少。

圖7 第4條測(cè)序通道為全部PCR產(chǎn)物樣品測(cè)序時(shí)的堿基分布圖Fig.7 Base distribution of all PCR samples sequencing on lane 4 of Illumina hiseq 2000

3 結(jié)語

作者研究探索了一套對(duì)普通PCR產(chǎn)物樣品的高通量測(cè)序建庫(kù)和上機(jī)實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)低多樣性樣品的高通量測(cè)序方法做了探索研究，通過對(duì)樣品的上機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)，證實(shí)所建立的方法保證樣品制備的高效經(jīng)濟(jì)和測(cè)序質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。

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Methods and Optimization of High Throughput Sequencing Technologies on PCR Products

LI Guilan1， XU Chuanlai2
（1.School of Life Sciences，Peking University，Beijing 100871，China；2.State Key Laboratory of Food Science &Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The development of the new generation sequencing technology extends the application field of gene sequencing.High throughput sequencing of PCR products has been widely used in functional gene screening，mutation and methylation detection of tumor related genes，etc.In the high throughput sequencing technology，database and computer sequencing experiments are the key factor to decide the quality of DNA data.Based on Illumina sequencing instruments，the sample preparation method and sequencing running for PCR products were optimized，the results make us clearly understand the primary features of high-throughput sequencing techniques，and provide us important references of sequencing methods for low diversity DNA samples to address biological questions of interest.

PCR products，high-throughput sequencing，sample library preparation，sequencing runs

Q 523.8

A

1673—1689（2016）12—1317—06

2015-02-03

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B071）。

李桂瀾（1980—），女，重慶人，理學(xué)博士，工程師，主要從事DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及生物分子相互作用方面的研究。E-mail：liglan@pku.edu.cn