邱霞琴，岳都盛

(昆山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇昆山 215316)

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HPLC法分析加熱對草魚紅肉中滋味物質(zhì)的影響

邱霞琴，岳都盛*

(昆山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇昆山 215316)

摘要[目的] 研究加熱前后草魚紅肉中滋味物質(zhì)的變化。[方法] 分別使用高效液相色譜儀和氨基酸自動分析儀分析了草魚紅肉中加熱前后核苷酸類物質(zhì)和游離氨基酸含量的變化。[結(jié)果] 新鮮草魚紅肉中核苷酸總量為1 088.809 μg/g。新鮮草魚紅肉中ATP含量為358.640 μg/g，加熱后為0。加熱后ADP、AMP、IMP、HxR和Hx的含量分別增加15.502、4.232、7.689、44.917和74.688 μg/g。新鮮草魚紅肉中游離氨基酸總量為3 129.106 μg/g，加熱后游離氨基酸總量減少了852.161 μg/g。其中，含量增加的游離氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，含量降低的游離氨基酸有蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸等。[結(jié)論] 該研究可為今后草魚熱制品的風味研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞草魚；紅肉；ATP及其關(guān)聯(lián)物；游離氨基酸

草魚，又名白鯇、厚魚、草根魚，一般棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，喜居于近岸多水草區(qū)域和水的中下層，為典型的食草性魚類。由于草魚生長迅速、肉質(zhì)肥嫩，營養(yǎng)豐富，已成為我國主要的養(yǎng)殖魚類之一，是我國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。草魚魚肉可分為白肉和紅肉2個部分。從營養(yǎng)學角度來看，白肉脂肪含量較低，脂肪中不飽和脂肪酸含量較高，肌纖維細致；紅肉脂肪含量較高，脂肪中飽和脂肪酸含量較高，肌纖維粗糙。從營養(yǎng)學角度來看，紅肉確實不如白肉，但這并不意味著要完全將紅肉拒之門外。與草魚白肉相比，草魚紅肉中含有較豐富的鋅、鐵等微量元素以及蛋白質(zhì)、核黃素、維生素B12等，這些成分對人體健康至關(guān)重要，尤其是正處于生長發(fā)育期的兒童。目前，對于草魚白肉部分的研究較多，且主要是針對魚肉的揮發(fā)性氣味成分的研究。施文正等[1]對草魚背肉和腹肉中的揮發(fā)性成分進行了分析。江健等[2]分析了草魚熟魚肉中的揮發(fā)性成分的組成。然而，對草魚魚肉中滋味成分的研究報道則偏少，對草魚紅肉的研究更為少見。為研究草魚紅肉中的滋味成分以及加熱對于滋味成分的影響，筆者使用高效液相色譜儀和氨基酸自動分析儀等分析了草魚紅肉中加熱前后核苷酸類物質(zhì)和游離氨基酸等水溶性成分的變化，旨在為今后草魚熱制品的風味研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗原料及其預處理草魚，購自江蘇省相城區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場，體質(zhì)量為2.0~2.5 kg/條，充氧后運回實驗室，暫養(yǎng)一段時間后宰殺。新鮮草魚宰殺后，沿脊背剖成2片，將上部分的白肉去除后，取接近皮組織部位的紅肉，將一部分紅肉置于蒸鍋內(nèi)，常壓下加熱15 min，自然冷卻后與新鮮紅肉一起備用。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑。三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤(Hx)標準品，均購自Sigma公司；一磷酸腺苷(AMP)標準品，由日本TCI公司生產(chǎn)；次黃嘌呤核苷(HxR)標準品，由德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)；高氯酸(AR)、氫氧化鉀(AR)、三氯乙酸(AR)、氫氧化鈉(AR)、磷酸(AR)、甲醇(GR)，均由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；磷酸氫二鉀(GR)和磷酸二氫鉀(GR)，均由上海安譜科學儀器公司生產(chǎn)。

1.2.2儀器。CFXB30-5M電飯鍋，為江門市威多福電器有限公司產(chǎn)品；AUW320電子分析天平和LC-2010CHT高效液相色譜儀，為日本島津公司產(chǎn)品；FA25均質(zhì)機，為Fluko公司產(chǎn)品；H2050R高速冷凍離心機，為長沙湘儀有限公司產(chǎn)品；雷磁PHS-3C酸度計，為上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；L8800日立氨基酸自動分析儀，為HITACHI公司產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.16種核苷酸類物質(zhì)的測定。6種核苷酸類物質(zhì)的測定參考Yokoyama等[3]的方法，并稍做改動。分別取新鮮紅肉及加熱后紅肉各5 g放置于50 mL離心管中，加入10 mL 10%的高氯酸，勻漿后以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液。將沉淀用5 mL 5%的高氯酸洗滌，再以相同的轉(zhuǎn)速離心取上清液，重復操作2次，合并上清液，用10 mol/L和1 mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH為6.5，靜止30 min后取上清液定容至50 mL，搖勻后0.45 μm膜過濾待測。整個操作在0~4 ℃環(huán)境中進行。

高效液相色譜(HPLC)條件：GL Sciences公司Inertsil ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A： 0.05 mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(1∶1)溶液，用磷酸調(diào)pH為6.5；流動相B： 甲醇溶液；等梯度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：10 μL；檢驗波長：254 nm。

1.3.2游離氨基酸含量的測定。參考張丹丹等[4]的方法，并稍做改動。分別取新鮮紅肉及加熱紅肉各2 g置于20 mL離心管中，加入15 mL 15%的三氯乙酸，勻漿后10 000 r/min離心15 min；取5 mL上清液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為2.0，然后定容至10 mL，搖勻后0.22 μm膜過濾待測。

氨基酸自動分析條件：色譜柱(4.6 mm×150 mm，7 μm)；柱溫50 ℃；1通道流速為0.4 mL/min，2通道流速為0.35 mL/min。流動相：pH為3.2、3.3、4.0、4.9的檸檬酸鈉和檸檬酸的混合緩沖液以及濃度為4%的茚三酮緩沖液。

1.4數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)均使用Excel和SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計與分析，結(jié)果均以平均值±標準差表示。

2結(jié)果與分析

2.16種核苷酸標準品的高效液相色譜圖從圖1可以看出，6種核苷酸物質(zhì)在15 min內(nèi)得到了有效分離，從左到右依次為肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、次黃嘌呤(Hx)、次黃嘌呤核苷(HxR)。

2.2草魚紅肉中核苷酸類物質(zhì)的含量分析從表1和圖2可以看出，新鮮草魚紅肉中三磷酸腺苷ATP的含量為358.640 μg/g，加熱后紅肉中ATP含量消失為零，這主要是因為ATP在活魚體內(nèi)占優(yōu)勢，它為魚體的活動代謝提供能量，活魚宰殺后ATP就會降解產(chǎn)生一系列的相關(guān)關(guān)聯(lián)物。隨著ATP的降解，ADP、AMP、IMP、HxR、Hx這幾種核苷酸在草魚紅肉中的含量分別由原來的124.593、56.397、459.249、40.682、49.248 μg/g增加到140.095、60.629、466.938、85.599、123.936 μg/g，增加量分別為12.442%、7.504%、1.674%、110.410%、151.657%。ATP、ADP、Hx和HxR含量變化顯著，而AMP和IMP含量無顯著變化。在這5種核苷酸中，ADP、AMP、IMP增加量小于Hx和HxR的增加量，這主要是因為ATP降解產(chǎn)生ADP、AMP、IMP、Hx和HxR后，ADP、AMP和IMP自身也會發(fā)生降解產(chǎn)生Hx和HxR。

圖1　ATP及其關(guān)聯(lián)物標準品的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC of the ATP-related standards

表1　草魚紅肉中核苷酸類物質(zhì)的含量

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters in the same column stand for significant differences(P<0.05).

圖2　草魚紅肉中ATP和IMP含量的變化Fig.2　Changes of ATP and IMP in grass carp red meat

2.3游離氨基酸標準品的高效液相色譜圖共檢查17種游離氨基酸，圖3中含有16種游離氨基酸標準品的色譜圖，從左到右依次為天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)，而脯氨酸(Pro)由另一通道體現(xiàn)。

圖3　游離氨基酸標準品的高效液相色譜圖Fig.3　Chromatogram of free amino acids standard substances

2.4草魚紅肉中游離氨基酸含量分析由表2可知，在新鮮草魚紅肉中含量較高的游離氨基酸主要有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸等，含量分別為103.080、440.991、279.528、131.251、1 300.120和210.077 μg/g，其相對百分含量分別為3.294%、14.093%、8.933%、4.195%、41.549%和6.714%；加熱后草魚紅肉中含量較高的游離氨基酸主要有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸等，含量分別為172.815、131.210、213.825、115.160、845.106和130.368 μg/g，其相對百分含量分別為7.590%、5.763%、9.391%、5.078%、37.116%和5.726%。加熱后魚肉中含量增加的游離氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，增加量分別為55.829%、67.651%、5.151%、6.127%、16.791%和13.164%；加熱后含量降低的游離氨基酸有蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸等，減少量分別為21.675%、8.475%、70.247%、23.505%、34.998%和37.943%。在游離氨基酸總量方面，新鮮草魚紅肉中的含量為3 129.106 μg/g，加熱后游離氨基酸總量為2 275.945 μg/g，加熱前后游離氨基酸總量減少了27.265%。出現(xiàn)這種情況的的主要原因有可能是因為游離氨基酸屬于水溶性物質(zhì)，加熱時會隨著水分的蒸發(fā)而流失，同時在加熱狀態(tài)下魚肉中的一部分蛋白質(zhì)會發(fā)生降解產(chǎn)生一定量的氨基酸，正是由于這2種因素共同作用才造成了游離氨基酸以及游離氨基酸總量的波動變化。

表2　草魚紅肉中游離氨基酸含量的變化

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercases in the same column stand for significant differences(P<0.05).

3討論與結(jié)論

ATP及其分解產(chǎn)物是水產(chǎn)動物肌肉中核苷酸的重要組成部分，國內(nèi)外對ATP在魚死后的降解途徑研究較多，一般認為是魚死后ATP在其體內(nèi)的的降解途徑為三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)[7]。同時，Saito等[8]在20世紀60年代還提出了以ATP及其分解產(chǎn)物作為魚貝類鮮度的指標。

同時，ATP的分解產(chǎn)物也與魚肉的風味有關(guān)。大多數(shù)人認為IMP是肉類物質(zhì)的主要呈味物質(zhì)，是一種鮮味極強的增鮮劑[9]，對魚肉的新鮮風味、適口感、美味等有重要貢獻。當與谷氨酸共存時IMP的呈味閾值下降，因此二者有明顯的鮮味增效作用[3]。Yokoyama等[3]認為AMP與糖原共同作用也可產(chǎn)生鮮味。高含量的Hx與腐敗魚肉的苦味有關(guān)，ATP及其前幾種分解產(chǎn)物向Hx的降解造成了Hx的堆積，同時導致了魚肉愉快風味的失去。

游離氨基酸在魚體內(nèi)屬于含氮化合物一類，它們是魚肉滋味物質(zhì)最主要的組成部分之一，對魚肉風味產(chǎn)生重要的影響[10]。與貝類相比，魚中游離氨基酸的含量較低，但是當某些游離氨基酸以足夠高的濃度存在于魚肉中時，它能夠獨立于其他成分而對魚的風味產(chǎn)生一定的作用[11]。據(jù)報道，甘氨酸對魚的甜味有一定的貢獻[12]，組氨酸造成了某些海產(chǎn)品中的“肉香”特征[13]，谷氨酸的鈉鹽具有鮮味。同時，魚肉中谷氨酸的鈉鹽還可與魚死后肌肉中所堆積的一磷酸腺苷產(chǎn)生協(xié)同作用，可以提高鮮味[14]。精氨酸可以增加魚肉呈味的復雜性程度并提高鮮度，甲硫氨酸則是海膽風味中不可缺少的呈味物質(zhì)[14]。

筆者以草魚紅肉作為研究對象，研究了其滋味物質(zhì)核苷酸和游離氨基酸的含量，同時對其進行加熱處理，并與新鮮紅肉進行對比，分析熱處理對草魚紅肉核苷酸和游離氨基酸含量的影響。結(jié)果表明，新鮮草魚紅肉中6種核苷酸的含量分別為358.640、124.593、56.397、459.249、40.682和49.248 μg/g，核苷酸總量為1 088.809 μg/g，這一結(jié)果與惠心怡[15]在淡水魚肉水溶性成分的分析中測得的草魚背肉中4種核苷酸(ATP、ADP、AMP、IMP)總量(5 660 μg/g)相比，其結(jié)果明顯小于惠心怡[15]的測定結(jié)果。加熱后紅肉中ATP消失不見。其他核苷酸含量均呈現(xiàn)不同程度的增加，這主要是因為ATP主要是為活魚的活動提供能量，魚死后ATP降解產(chǎn)生一系列的相關(guān)產(chǎn)物。

該試驗中新鮮草魚紅肉中含量較高的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸等；加熱后紅肉中含量較高的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸等。在草魚紅肉中加熱前后含量增加的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，增加量分別為55.829%、67.651%、5.151%、6.127%、16.791%和13.164%；含量降低的有蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸等，減少量分別為21.675%、8.475%、70.247%、23.505%、34.998%，37.943%。該試驗測得新鮮草魚紅肉中游離氨基酸總量為3 129.106 μg/g，小于惠心怡[15]測得的游離氨基酸總量(3 889 μg/g)。

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Study on the Effects of Heating on the Flavor Substances in the Red Meat of Grass Carp by HPLC

QIU Xia-qin，YUE Du-sheng*(Product Quality Supervision and Inspection Institute of Kunshan, Kunshan, Jiangsu 215316)

Abstract[Objective] To study the changes of flavor substances in red meat of grass carp before and after heating. [Method] The content changes of nucleotides and free amino acids in red meat of grass carp were analyzed by using high-performance liquid chromatograph and automatic amino acid analyzer. [Result] The total content of nucleotides in red meat of fresh grass carp was 1 088.809 μg/g. ATP content in red meat of fresh grass carp was 358.640 μg/g and it reduced to zero after heating. The contents of ADP, AMP, IMP, HxR and Hx after heating increased 15.502, 4.232, 7.689, 44.917 and 74.688 μg/g, respectively. The total content of free amino acids in red meat of grass carp was 3 129.106 μg/g, and it decreased 852.161 μg/g after heating. Among the free amino acids, the contents of aspartic acid, glutamic acid, valine, methionine, leucine and tyrosine increased, and the contents of threonine, serine, glycine, alanine, lysine, histidine decreased. [Conclusion] The research can lay the theoretical foundation for further study on the flavor of heated products of grass carp.

Key wordsGrass carp; Red meat; ATP and ATP-related substances; Free amino acids

收稿日期2015-12-17

作者簡介邱霞琴(1977- )，女，江蘇昆山人，助理工程師，從事食品檢測方法及食品管理體系研究。*通訊作者，工程師，從事食品檢測工作。

中圖分類號S 965.112

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-090-04