張璐璐， 嚴(yán) 興， 趙 勇*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306;2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析在嗜熱鏈球菌菌株分型中的應(yīng)用

張璐璐1,3， 嚴(yán) 興2*， 趙 勇1,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306;2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

為了建立適用于嗜熱鏈球菌菌株資源多樣性調(diào)查的菌株分型方法，嘗試將1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析用于嗜熱鏈球菌的菌株分型，并與常用ERIC-PCR指紋圖譜方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析可以把30株從三個(gè)不同樣品中分離的嗜熱鏈球菌分成三種差異明顯的類型：不同類型菌株之間沒有相同的間區(qū)序列；而同一類型菌株之間，間區(qū)序列的組成和排列則基本一致，并且上述分型的結(jié)果與用ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)獲得的結(jié)果完全一致。因此，1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析是嗜熱鏈球菌分型鑒定的可靠方法，并適用于大量菌株的分型鑒定和多樣性調(diào)查。

嗜熱鏈球菌；1型CRISPR位點(diǎn)；間區(qū)序列分析；ERIC-PCR指紋圖譜；菌株分型

嗜熱鏈球菌是發(fā)酵乳品工業(yè)中最為重要的乳酸菌之一，可以產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)如乳酸、乙醛和丁二酮來調(diào)節(jié)酸奶風(fēng)味[1]。同時(shí)，嗜熱鏈球菌可以縮短酸奶的凝乳時(shí)間，增加酸奶制品的黏度，改善酸奶的后酸化現(xiàn)象[2]。此外，其益生特性可以增強(qiáng)酸奶的保健功能[3]。人們已經(jīng)從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品分離了大量的嗜熱鏈球菌，對(duì)這些菌株進(jìn)行分型，可以為乳品發(fā)酵工業(yè)提供更多菌株資源。目前，基于指紋圖譜的分析方法是嗜熱鏈球菌分型研究中最為常用的方法[4-6]，例如，隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(random amplification of polymorphic DNA，RAPD)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment-length polymorphism，AFLP)等指紋圖譜方法都已經(jīng)被用于嗜熱鏈球菌的菌株分型等。但是這些基于指紋圖譜的分析方法具有很大的局限性。首先，指紋圖譜的分析方法容易受到實(shí)驗(yàn)條件的影響，不同實(shí)驗(yàn)室得到的指紋圖譜相互之間很難進(jìn)行比較；其次，指紋圖譜的分型方法也不易于對(duì)大量的菌株信息進(jìn)行存儲(chǔ)和比較[7]。多位點(diǎn)序列分型(Multiple loci sequence typing，MLST)是近些年出現(xiàn)的菌株分型的新方法。MLST通過對(duì)菌株的多個(gè)保守基因進(jìn)行測(cè)序進(jìn)而達(dá)到分型的目的，這是一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的分型方法，但是因?yàn)樾枰獙?duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序所以成本比較高。Yu等利用MLST的方法對(duì)從蒙古國(guó)和中國(guó)的18個(gè)地區(qū)發(fā)酵乳制品中分離的239株嗜熱鏈球菌進(jìn)行了分型。雖然通過MLST獲得了可靠的分型結(jié)果，但是這種方法需要同時(shí)對(duì)嗜熱鏈球菌的10個(gè)持家基因(carB、clpX、dnaA、murC、murE、pepN、pepX、pyrG、recA和rpoB)進(jìn)行測(cè)序，然后再進(jìn)行分型分析[8]，顯得十分繁瑣。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)是一類廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)[10-11]。CRISPR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是包括一段由不連續(xù)的同向重復(fù)序列(direct repeat，DR)間隔著28～32 bp的非重復(fù)間區(qū)序列(spacer)組成的區(qū)域。一般來說，同一個(gè)菌種CRISPR位點(diǎn)的同向重復(fù)序列絕大多數(shù)非常保守[12]， RNA穩(wěn)定性預(yù)測(cè)證明同向重復(fù)序列傾向于形成短的回文結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)可能是CAS蛋白的識(shí)別標(biāo)記[13]。Barrangou等發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間區(qū)序列來源于侵染宿主的噬菌體[14]，因此間區(qū)序列具有很高的特異性，即使在同一物種的不同菌株間，間區(qū)序列也往往不同[15]，間區(qū)序列的高度變異性使它適用于同一菌種不同菌株分型的分子標(biāo)記，它實(shí)際上反映了不同菌株對(duì)應(yīng)環(huán)境的適應(yīng)過程。在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了三種類型的CRISPR位點(diǎn)，其中類型1的CRISPR位點(diǎn)是所有嗜熱鏈球菌都具有的。Bolotin等[16]、Horvath等[17]針對(duì)嗜熱鏈球菌的1型CRISPR位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)了保守引物，可以用于1型CRISPR位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。由于CRISPR中間區(qū)序列的高度可變性，因此可以作為對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行菌株分型的理想分子標(biāo)記。ERIC-PCR是一種基于長(zhǎng)引物的隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性指紋圖譜技術(shù)(LP-RAPD)，由于其引物比較長(zhǎng)且PCR退火溫度比較高，因此具有比RAPD指紋圖譜更高的穩(wěn)定性和重復(fù)性[18]。這一技術(shù)已經(jīng)廣泛用于包括Corynebacteriumpseudotuberculosis、Salmonella、Listeria、Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus等多種微生物菌種的分型[19-22]。本研究將同時(shí)利用1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析和ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)對(duì)從三個(gè)家庭手工發(fā)酵酸奶中分離獲得的30株嗜熱鏈球菌進(jìn)行分型，并對(duì)它們之間的分析結(jié)果和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料和菌株 家庭手工制作的酸奶樣品采集自陜西省；嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基采用M17固體培養(yǎng)基(英國(guó)Oxiod公司)。

1.1.2 材料與試劑rTaqDNA聚合酶和LATaqDNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；Dpx高保真DNA聚合酶購(gòu)自上海吐露港生物科技有限公司；三菱AnaeroPackSystem-Anaero厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自日本Mitsubishi Gas化學(xué)公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；其他生化試劑購(gòu)自上海生物工程公司。

1.1.3 主要儀器 Mastercycler?pro s梯度PCR儀(德國(guó)eppendorf公司)，Tanon-EPS 300電泳儀(上海天能科技有限公司)，Bio-rad凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌的分離 按常規(guī)方法分離酸奶樣品中的嗜熱鏈球菌，具體步驟如下：將酸奶樣品利用滅菌的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋并涂于M17平板培養(yǎng)基上，置于厭氧罐中43 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單克隆于盛有M17液體培養(yǎng)基的96孔板中，置于厭氧罐中43 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 分離菌株基因組DNA的提取 使用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.2.3 分離菌株的鑒定與分型 ①分離菌株的16S rRNA基因鑒定：以分離菌的基因組DNA為模板，引物采用27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，并利用rTaqDNA聚合酶擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因，并用引物27F進(jìn)行測(cè)序，通過序列比對(duì)確定分離菌株種屬。②分離菌株的ERIC-PCR 指紋圖譜分析：以分離菌株的基因組DNA為模板，利用LATaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下： 25 μL反應(yīng)體系中包含2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+free)，2 μL 25 mmol/L MgCl2溶液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP, 20 μmol/L E1(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)和E2(5′-AAGTAAGTgACTGGGGTGAGCG-3′)引物各0.5 μL ，模板DNA 40～80 ng，2.5 ULATaqDNA聚合酶，用雙蒸餾水補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性7 min(預(yù)變性之后加入LATaqDNA聚合酶)； 94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 65 ℃ 8 min，共30 個(gè)循環(huán);最后 65 ℃退火 16 min。用Quantity One軟件分析ERIC-PCR指紋圖譜，結(jié)果導(dǎo)入到Past軟件中，使用Dice相似性系數(shù)進(jìn)行指紋圖譜之間相似性的計(jì)算，在此基礎(chǔ)上使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)算法構(gòu)建聚類矩形圖。③分離菌株的1型CRISPR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增： 以分離菌的基因組DNA為模板，利用Dpx高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。 50 μL反應(yīng)體系中包括5 μL 10×Dpx Buffer，5 μL 2 mmol/L dNTP，嗜熱鏈球菌1型CRISPR位點(diǎn)特異性引物YC70(5′-TGCTGAGACAACCTAGTCTCTC-3′)和CR1-rev (5′-TAAACAGAGCCTCCCTATCC-3′)各0.5 μL，5 U Dpx DNA聚合酶，模板DNA 30～50 ng，用雙蒸水補(bǔ)足體系到50 μL。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，然后用引物YC70和CR1-rev對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并最終測(cè)通。④分離菌株的1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析： 將分離菌株的CRISPR測(cè)序結(jié)果提交CRISPR Finder(http://crispr.u-psud.fr/Server/)鑒定其中的間區(qū)序列。序列不同的間區(qū)分別用不同的方格圖案染色表示，并按照在CRISPR位點(diǎn)中的順序進(jìn)行排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌的分離

使用M17培養(yǎng)基從樣品SX1、SX2和SX3中分別分離了8株、8株和14株菌，通過16S rRNA基因序列測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)菌株S.thermophilesATCC 19258的相似性在99.5%～100%之間，表明它們都屬于嗜熱鏈球菌。

圖1 分離菌株的ERIC-PCR指紋圖譜(每種亞型至少選擇一個(gè)菌株，見圖2)Fig.1 ERIC-PCR fingerprints of S. thermophiles isolates (At least one strain was selected from each subtype in Fig.2)M：DNA分子標(biāo)記M：DNA marker

2.2 嗜熱鏈球菌的ERIC-PCR指紋圖譜分析

ERIC-PCR指紋圖譜分析是常規(guī)的菌株分型方法，首先用這一常規(guī)方法對(duì)分離獲得的30株嗜熱鏈球菌進(jìn)行了菌株分型，如圖1所示，這些菌株的指紋圖譜在1.3 kb處共有一條主帶，這條共有的優(yōu)勢(shì)條帶可能是嗜熱鏈球菌所特異性擁有的。在樣品SX1中，可以明顯觀察到8號(hào)菌株與其他3株菌的差異，即在1.5 kb以上比其他菌株多了3條微弱卻單一的條帶；在樣品SX2中1、3號(hào)和2、5號(hào)菌株的差異則在2 kb左右的條帶上；樣品SX3中，10號(hào)菌株與其他3株相比缺少了在900 bp左右處的條帶。對(duì)這些指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明從3個(gè)樣品中分離到的嗜熱鏈球菌分別聚為3個(gè)cluster，表明這些乳酸菌可以根據(jù)分離的樣品分為3種類型。同一類型中的乳酸菌具有比較高的相似度，指紋圖譜的相似性都在80%以上(圖2)。同一類型的樣品內(nèi)部又可以分為2種亞型，共6種亞型，即Type1-1、Type1-2、Type2-1、Type2-2、Type3-1和Type3-2，每個(gè)亞型的指紋圖譜是完全相同的。

圖2 30株嗜熱鏈球菌ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析結(jié)果Fig.2 Clustering analysis of ERIC-PCR fingerprintings for 30 S. thermophiles isolates

2.3 嗜熱鏈球菌1型CRISPR位點(diǎn)的擴(kuò)增及間區(qū)序列分析

首先利用嗜熱鏈球菌特異性引物對(duì)分離獲得的30株菌的1型CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。如圖3所示，這30株嗜熱鏈球菌均可擴(kuò)增出單一的條帶，且條帶大小都在2 kb到3 kb之間，通過瓊脂糖凝膠電泳很難分辨出它們大小的差異。所以，根據(jù)ERIC-PCR 聚類結(jié)果選出16個(gè)代表菌株(包含了所有的亞型)并對(duì)其1型CRISPR位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序。

隨后通過CRISPR Finder對(duì)16株嗜熱鏈球菌的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行序列分析，找出每個(gè)菌株CRISPR位點(diǎn)內(nèi)的間區(qū)序列。其中，為了更加直觀地比較CRISPR片段中間區(qū)序列的差異，不同的間區(qū)序列采用不同的圖案來表示(圖4)。從圖4可以看出，從樣品SX2中分離的4株菌的1型CRISPR位點(diǎn)均含有27個(gè)間區(qū)序列且間區(qū)序列的組成和排列完全相同；從樣品SX1中分離的6株菌的1型CRISPR位點(diǎn)均含有20個(gè)間區(qū)序列且間區(qū)序列的組成和排列完全相同；從樣品SX3中分離的6株菌的1型CRISPR位點(diǎn)均含有27到28個(gè)間區(qū)序列，菌株SX3-5和SX3-8的CRISPR位點(diǎn)比其他4個(gè)菌株缺少一個(gè)間區(qū)，除此之外6個(gè)菌株CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列的組成和排列完全相同。因此根據(jù)CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列的比對(duì)情況，所有不同分離來源的菌株可以明顯分為3種類型(圖4)：不同類型菌株間沒有相同的間區(qū)序列；而同一類型菌株間，間區(qū)序列的組成和排列則基本一致。通過對(duì)同一菌株的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有些間區(qū)序列重復(fù)出現(xiàn)了幾次，例如從樣品SX2分離的4株菌中，每個(gè)菌株均含有5對(duì)重復(fù)的間區(qū)序列，分別為S12和S20、S13和S21、S14和S22、S15和S23、S16和S24；而從樣品SX1分離的6株菌中，每個(gè)菌株均含有1對(duì)重復(fù)的間區(qū)序列，即S14和S17，類似的現(xiàn)象也曾出現(xiàn)在S.thermophilesDGCC 6297的1型CRISPR位點(diǎn)中[17]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是菌株被相似的噬菌體侵染過，或者是CRISPR序列自我復(fù)制形成的。

圖3 30株嗜熱鏈球菌CRISPR位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained from CRISPR1 locus for 30 S. thermophiles isolates

圖4 16株代表菌株的CRISPR中間區(qū)序列的排布示意圖Fig.4 Arrangement of spacers across the CRISPR locus for S. thermophiles strains序列不同的間區(qū)序列用不同圖案的方塊表示Each spacer is represented by a combination of one select character in a particular font color, on a particular background color

2.4 兩種分型方法的結(jié)果比較

用1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析對(duì)30株嗜熱鏈球的分型結(jié)果與常規(guī)的ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)獲得的結(jié)果基本一致，說明1型CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析是嗜熱鏈球菌分型鑒定的可靠方法。但是研究發(fā)現(xiàn)兩種分析方法獲得的結(jié)果之間也存在一些差異，ERIC-PCR指紋圖譜分析似乎對(duì)于菌株間基因組的變異更為敏感，可以把同一類型的菌株分為更多的亞型。

3 討 論

由于CRISPR位點(diǎn)的間區(qū)序列來源于侵染宿主的噬菌體，所以CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列反映了噬菌體與宿主之間的相互識(shí)別，同時(shí)CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列的排列也反映了菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果，這可能是CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列能夠應(yīng)用菌株分析的原因。

由于不適用于大量的菌株信息的存儲(chǔ)和比較，所以包括ERIC-PCR在內(nèi)的、基于指紋圖譜的方法在對(duì)大量菌株進(jìn)行分型時(shí)存在明顯的劣勢(shì)。而基于CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析的分型方法正可以彌補(bǔ)這一缺陷，可以將不同菌株的間區(qū)序列及其排序存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中并進(jìn)行相互比較。而與需要對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序的MLST技術(shù)相比較，CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列分析的分型方法只需要測(cè)定一個(gè)CRISPR位點(diǎn)(一般小于4 kb)，所以分型速度更快、成本更低。根據(jù)本研究的結(jié)果，甚至只需要測(cè)定CRISPR位點(diǎn)兩頭的序列就可以達(dá)到相同的分型效果。因此基于CRISPR位點(diǎn)間區(qū)的序列分析可能會(huì)在包括嗜熱鏈球菌等普遍含有CRISPR位點(diǎn)的微生物菌株分型中有廣泛應(yīng)用前景。

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Application of Spacers of CRISPR 1 Locus to TypingStreptococcusthermophilesStrains

ZHANG Lu-lu1, 3, YAN Xing2, ZHAO Yong1, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.KeyLab.ofSynth.Biol.,ShanghaiInst.ofPlantPhysiol. &Ecol.,ChineseAcad.ofSci.,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm’tforAquaticProd.onStorage&Preserv’n(Shanghai),MinistryofAgric.Shanghai201306)

In order to establish a strain typing method suitable for investigating the diversity ofStreptococcusthermophilesresources based on spacers of CRISPR 1 locus attempted to analyze the strain typing ofS.thermophilesand compared with the routine ERIC-PCR finger print spectrum method. The results showed that the spacers CRISPR 1 locus sequence analyses could divide 30 strains isolated from three different samples into three types with obvious differences: there were no similar spacer among different type of strains; and the component and arrangement among the same type of strain were basically consistent, and furthermore the results of the above mentioned typing totally accorded with the results obtained by ERIC-PCR finger print spectrum technology. Therefore, analyses on spacers of CRISPR1 locus was a reliable method for typing characterization of strains ofS.thermophilesand was especially suitable for typing classification and diversity investigation at large amount of strains.

Streptococcusthermophiles; CRISPR1 locus; spacer sequence analysis; ERIC-PCR finger print spectrum; strain typing

中國(guó)科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃(STS計(jì)劃)項(xiàng)目(KFJ-EW-STS-029)

張璐璐 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail:llzhang0907@163.com

* 通訊作者。嚴(yán)興 男，副研究員，博士。研究方向?yàn)楣I(yè)微生物收集與保藏。Tel:021-54924049, E-mail:yanxing@sibs.ac.cn

2016-01-06；

2016-03-14

Q93-31;TS252.42

A

1005-7021(2016)06-0029-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.005

趙勇 男，教授，博士。研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。Tel:021-61900503, E-mail: yzhao@shou.edu.cn