樊秦娥，胡楊根，葉方

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，湖北 十堰 442000)

熒光光度法測(cè)定竹葉柴胡地上部分不同部位總黃酮含量

樊秦娥，胡楊根，葉方

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，湖北 十堰 442000)

目的 分析竹葉柴胡不同部位總黃酮含量，研究黃酮在柴胡不同部位的分布，為中藥資源合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。方法以蘆丁為對(duì)照品，以5%硝酸鋁與樣品中黃酮成分產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)，選擇激發(fā)波長(zhǎng)λex=445 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=484 nm，應(yīng)用熒光光度法測(cè)樣品的熒光光度值，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果以蘆丁在0.198～3.168 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度線(xiàn)性關(guān)系良好，y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3。竹葉柴胡花、葉、莖中總黃酮含量最分別為3.08%、1.85%、0.41%。結(jié)論竹葉柴胡花、葉中總黃酮含量較高，應(yīng)在開(kāi)花期采收竹葉柴胡地上部分。

竹葉柴胡；總黃酮；熒光光度法

柴胡為傘形科柴胡屬多年生草本植物，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名茈胡，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的功效，《中國(guó)藥典》收載(北)柴胡Bupleurum chinense DC.和南柴胡(狹葉柴胡)B.scorzoneri folium Willd.作為正品柴胡[1]，但除大葉柴胡外，很多其他柴胡品種在藥材市場(chǎng)上也作為柴胡廣泛應(yīng)用[2]。鄂西北地區(qū)主要分布竹葉柴胡(Bupleurum marginatum Wall ex DC)，習(xí)慣以北柴胡之名遠(yuǎn)銷(xiāo)國(guó)內(nèi)外，品質(zhì)較好[3]。柴胡中主要含有皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)活性成分，皂苷類(lèi)成分具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、保肝、抗腫瘤等藥理作用，黃酮類(lèi)成分具有殺菌、抗病毒等作用[4-6]，黃酮類(lèi)化合物主要分布在植株的地上部分[7]，竹葉柴胡植物地上部分占植株的比例較大，生產(chǎn)中通常都被丟棄，造成了資源浪費(fèi)。為了更好地利用中藥資源，進(jìn)一步考察不同部位黃酮成分分布情況，我們對(duì)地上部分花、莖、葉中總黃酮含量進(jìn)行分析比較，為開(kāi)發(fā)利用地上部分提供參考。

1 儀器與材料

F-7000熒光光譜儀(日立)；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博弈實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，MBE-20A 1000克密封型搖擺式粉碎機(jī)(溫嶺市邁邦機(jī)械設(shè)備有限公司)，SQP分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，KQ-250D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空水泵(河南宇科自動(dòng)化儀器儀表設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)。

柴胡藥材采自湖北醫(yī)藥學(xué)院百草園，由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院葉方副教授鑒定，見(jiàn)表1。去雜質(zhì)，枯枝，洗凈，45℃烘干，粉碎，過(guò)3號(hào)篩備用。蘆丁對(duì)照品(GR-133-140106)購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

表1 柴胡樣品及來(lái)源、含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并稀釋至刻度，冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡樣品粉末1 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加石油醚25 mL，70℃水浴回流2 h，棄石油醚液，藥渣揮干石油醚后加60%乙醇30 mL，70℃回流提取2 h，濾過(guò)，60%乙醇洗滌藥渣和容器，合并濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度[8]得溶液A1～A5。從A1～A5中精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，以60%乙醇稀釋至刻度，得到供試品溶液B1～B5。

2.3 測(cè)定方法及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取0.5 mL對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶中，加入5%硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的HAc-NaAc緩沖溶液3 mL，用60%乙醇稀釋至刻度[9]。精密量取B1溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，同法操作。根據(jù)蘆丁等黃酮類(lèi)成分在酸性條件下與硝酸鋁反應(yīng)產(chǎn)生熒光物質(zhì)的特點(diǎn)，取兩種溶液進(jìn)行激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描：固定激發(fā)波長(zhǎng)(λex)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)(λem)在200～700 nm范圍內(nèi)蘆丁對(duì)照品及樣品溶液熒光強(qiáng)度，結(jié)果最佳λem為484 nm，見(jiàn)圖1；固定λem484 nm，掃描λex在200～700 nm范圍內(nèi)蘆丁對(duì)照品及樣品溶液熒光強(qiáng)度，結(jié)果最佳λex為445 nm，見(jiàn)圖2～圖4。因此，確定測(cè)定波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為445 nm，發(fā)射波長(zhǎng)484 nm，狹縫寬度為5 nm。

圖1 固定激發(fā)波長(zhǎng)，掃描對(duì)照品發(fā)射波長(zhǎng)

圖2 固定發(fā)射波長(zhǎng)，掃描對(duì)照品激發(fā)波長(zhǎng)

圖3 固定激發(fā)波長(zhǎng)，掃描樣品發(fā)射波長(zhǎng)

圖4 固定發(fā)射波長(zhǎng)，掃描樣品激發(fā)波長(zhǎng)

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取此溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%的硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以60%乙醇溶液作空白對(duì)照，按“2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果蘆丁的線(xiàn)性回歸方程為：y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3，說(shuō)明在0.198～3.168 μg/mL范圍內(nèi)蘆丁濃度與其熒光強(qiáng)度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL，按照“2.3”項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度5次，記錄熒光強(qiáng)度值。結(jié)果RSD為0.24%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，按樣品測(cè)定方法操作，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果RSD為0.92%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h內(nèi)測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果RSD為0.89%，表明樣品供試品溶液在4 h內(nèi)檢測(cè)對(duì)結(jié)果無(wú)影響，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品21.04 mg，稀釋至50 mL量瓶中，得到0.42 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取4號(hào)樣品0.5 g于50 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 0.42 mg/mL的對(duì)照品溶液，依次按照“2.2”及“2.3”方法處理進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率(n=6)，結(jié)果平均回收率為97.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%，見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 精密吸取供試品溶液B1～B5各0.5 mL于10 mL容量瓶中，按“2.3”方法測(cè)定熒光光度值，以60%乙醇溶液作為空白對(duì)照，計(jì)算樣品中總黃酮的含量，樣品1（生長(zhǎng)部位：葉，2年）總黃酮含量0.35%；樣品2（生長(zhǎng)部位：葉，1年）1.85%；樣品3（生長(zhǎng)部位：花，1年）3.08%；樣品4（生長(zhǎng)部位：莖，1年）0.41%；樣品5（生長(zhǎng)部位：莖，2年）0.95%。

表2 蘆丁加樣回收率

3 討 論

竹葉柴胡莖、葉、花中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果顯示，1年生柴胡花中總黃酮含量最高，為3.08%，葉中總黃酮含量為1.85%，莖中總黃酮含量最低，只有0.41%。2年生柴胡花中總黃酮沒(méi)有檢測(cè)，但2年生柴胡葉中總黃酮含量低于1年生，而莖中含量高于1年生柴胡，1年生柴胡莖葉中黃酮總量高于2年生柴胡，說(shuō)明柴胡不同部位黃酮類(lèi)成分的累積規(guī)律與生長(zhǎng)周期的變化不呈相關(guān)性。如果以柴胡總黃酮作為主要療效成分時(shí)，應(yīng)在一年生柴胡開(kāi)花期采收，同時(shí)由于莖中總黃酮含量較低，所以在種植中可以通過(guò)給柴胡打頂收集柴胡葉和花作為原料，即能保證柴胡主要藥用部位根莖的生長(zhǎng)，還能綜合利用資源。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015: 280-281.

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Determination of total flavonoids in different aerial parts of Bupleurum marginatum by fluorescence spectrophotometry.

FAN Qin-e,HU Yang-gen,YE Fang.Department of Obstetrics,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College(Taihe Hospital of Shiyan),Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a method to determine the total flavonoid levels in flower,leaves and stalk of Bupleurum marginatum by Spectrofluorimetry,and to provided a reference for reasonable development and utilization of traditional Chinese medicine resources.MethodsBased on fluorescent property that flavonoids could make a stable complexation with Al3+,and the excitation and emission wavelengths were selected at 445 nm and 484 nm respectively with rutin as the standard sample.The total flavonoids levels were determined in the sample by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe fluorescence intensity had a good linear relationship with rutin concentration in the range of 0.198～3.168 μg/mL.The regression equation was found to bey=0.972 8x-0.001,r2=0.999 3.The content of flavonoids in flower,leaves and stalk were 3.08%,1.85%,0.41%,respectively.ConclusionThe flower,leaves of Bupleurum marginatum contain relatively higher levels of total flavonoids,which provides a reference for harvesting the aerial parts of Bupleurum marginatum in flowering period.

Bupleurum marginatum;Total flavonoids;Fluorescence spectrofluorimetry

R93

A

1003—6350（2016）20—3319—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.017

2016-04-22)

胡楊根。E-mail：wuerfan@sina.com