張平，陳曉波，廖陳曾，李萬(wàn)強(qiáng)，肖建華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼對(duì)前列腺癌細(xì)胞株DU145增殖和侵襲的影響

張平，陳曉波，廖陳曾，李萬(wàn)強(qiáng)，肖建華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 DU145細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，融合達(dá)80%時(shí)用胰酶消化后傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)空白對(duì)照組(用同體積培養(yǎng)基)、環(huán)靶明組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，孵育24 h后棄培養(yǎng)基，按分組加入相應(yīng)藥物(終濃度為環(huán)靶明2.5 μmol/L、吉非替尼10 μmol/L、環(huán)靶明2.5 μmol/L+吉非替尼10 μmol/L)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，作用20 h時(shí)每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩溶解10 min后490 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值，抑制率=[(空白對(duì)照組A值-藥物組A值)/空白對(duì)照組A值]×100%。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸，調(diào)整密度為4×105/mL，將經(jīng)過(guò)Matrigel膠包被制好的Transwell小室置入24孔板，取100 μL細(xì)胞懸液加入小室上層并按分組加入不同藥物(同1.3)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另取600 μL含10%血清的培養(yǎng)基加入小室下層，孵育24 h后取出，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色，浸洗后揭膜并樹膠封片，隨機(jī)觀察6個(gè)視野(×200)，顯微鏡下計(jì)數(shù)平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞懸液接種于10 cm培養(yǎng)皿中，按分組加入不同藥物(同1.3)，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞加入RIPA裂解液，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)PVDF膜，牛奶封閉1 h，一抗孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色。取目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值用作半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用Bonferroni t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響 各藥物處理組細(xì)胞吸光度(A)值均低于空白對(duì)照組(P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組吸光度值低于環(huán)靶明(t=4.6487，P=0.001)和吉非替尼單藥組(t=6.024 5，P＜0.01，見(jiàn)圖1，表1)。環(huán)靶明、吉非替尼和聯(lián)合給藥組的抑制率分別為(43.16± 8.88)%、(35.97±11.26)%和(68.14±4.15)%。

表1 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(n=6,±s)

表1 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(n=6,±s)

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與聯(lián)合用藥組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合用藥組比較，bP＜0.05。

組別 吸光度（A值） 穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）空白對(duì)照組吉非替尼組環(huán)靶明組聯(lián)合用藥組1.2103±0.1252 0.7726±0.1474ab0.6839±0.0989ab0.3842±0.0518a58.6667±8.6872 41.1667±6.3377ac39.5000±5.6480ac28.3333±3.3863a

圖1 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響(吸光度值，n=6)

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞侵襲的影響 各藥物處理組平均穿膜細(xì)胞數(shù)均小于空白對(duì)照組(P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組平均穿膜細(xì)胞數(shù)小于環(huán)靶明組(t= 3.067 7，P=0.036)和吉非替尼單藥組(t=3.525 6，P= 0.013，見(jiàn)圖2，表1)。

圖2 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞侵襲的影響(×200，結(jié)晶紫染色，n=6)

2.3 聯(lián)合用藥后DU145細(xì)胞中SHH、PTCH和Gli-1蛋白表達(dá)的變化 環(huán)靶明組及聯(lián)合用藥組各通路蛋白的表達(dá)均低于空白對(duì)照組(P＜0.01)；吉非替尼組僅PTCH蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組(t=4.149 5，P=0.019)；聯(lián)合用藥組PTCH蛋白表達(dá)低于環(huán)靶明組(t=3.668 6，P=0.038)或吉非替尼單藥組(t=4.553 9，P=0.011，見(jiàn)圖3、表2)。

圖3 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞中Hh通路蛋白表達(dá)的影響(相對(duì)表達(dá)量，n=3)

表2 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞中Hh通路蛋白表達(dá)的影響(相對(duì)表達(dá)量，n=3,±s)

表2 聯(lián)合用藥對(duì)DU145細(xì)胞中Hh通路蛋白表達(dá)的影響(相對(duì)表達(dá)量，n=3,±s)

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與空白對(duì)照組比較，bP＜0.05；與聯(lián)合用藥組比較，cP＜0.05。

組別空白對(duì)照組吉非替尼組環(huán)靶明組聯(lián)合用藥組SHH 0.9529±0.0979 0.9202±0.0726 0.5799±0.1080a0.5604±0.0857aPTCH 1.1112±0.1157 0.7531±0.1287bc0.6767±0.0815ac0.3601±0.0900aGil-1 0.9805±0.1147 0.9508±0.0855 0.6100±0.0879a0.5802±0.0914a

3 討 論

前列腺癌的發(fā)病率逐年增高，因?yàn)榍捌诎Y狀隱匿，相當(dāng)比例的患者就診時(shí)已進(jìn)展至疾病晚期?，F(xiàn)行的綜合治療措施難以進(jìn)一步提高晚期患者的生存質(zhì)量并降低死亡率，探索更有效的治療方案成為臨床亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前針對(duì)特定信號(hào)通路的靶向藥物的研究為晚期前列腺癌的治療帶來(lái)新的選擇，并有望獲得突破性進(jìn)展。

Hedgehog信號(hào)通路和酪氨酸激酶受體通路是與人體腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的兩條主要信號(hào)通路?；罨腍h通路蛋白SHH、PTCH及Gli-1等在多種人體腫瘤中表達(dá)異常[3-4]。環(huán)靶明作為特異性的Hh通路抑制劑，可通過(guò)下調(diào)Hh通路成員的蛋白表達(dá)，阻斷相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮抑癌作用[5]。腫瘤患者體內(nèi)也觀察到酪氨酸激酶受體通路的異常活化，以EGFR為代表的受體酪氨酸激酶在多種惡性實(shí)體瘤中過(guò)度表達(dá)[6-7]。吉非替尼作為EGFR酪氨酸激酶的高選擇性拮抗劑，可通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制激酶活化而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[8]。

已有研究顯示環(huán)靶明和吉非替尼均可抑制雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[1-2]。由于前列腺癌的惡性進(jìn)展涉及多種分子途徑的異常調(diào)控，因此聯(lián)合應(yīng)用針對(duì)不同途徑的靶向藥物有可能獲得協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)，是否環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼作用于前列腺癌可獲得類似效應(yīng)，目前相關(guān)的報(bào)道有限。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩者聯(lián)合作用后前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單藥對(duì)照組，且聯(lián)合用藥較單一用藥更明顯地抑制了前列腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力，結(jié)果表明環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼作用于前列腺癌可以獲得協(xié)同增強(qiáng)的抑癌效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了聯(lián)合用藥后Hh信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組PTCH蛋白的表達(dá)明顯低于單藥對(duì)照組，提示聯(lián)合用藥通過(guò)進(jìn)一步下調(diào)PTCH的表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)Hh通路的抑制作用，結(jié)果也提示聯(lián)合用藥獲得增強(qiáng)的抑癌效應(yīng)的機(jī)制可能與吉非替尼協(xié)同環(huán)靶明下調(diào)Hh通路的PTCH蛋白表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為臨床探索晚期前列腺癌的靶向治療方案提供了新的思路。

[1]孫全武,周逢海,王養(yǎng)民,等.環(huán)巴胺對(duì)DU145細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響[J].中華男科學(xué),2010,16(3):227-231

[2]Vicentini C,Festuccia C,Gravina GL,et al.Prostate cancer cell proliferation is strongly reduced by the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor ZD1839 in vitro on human cell lines and primary cultures[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):165-174.

[3]Hong Z,Bi A,Chen D,et al.Activation of hedgehog signaling pathway in human non-small cell lung cancers[J].Pathol Oncol Res, 2014,20(4):917-922.

[4]Wang YF,Chang CJ,Lin CP,et al.Expression of hedgehog signaling molecules as a prognostic indicator of oral squamous cell carcinoma [J].Head Neck,2012,34(11):1556-1561.

[5]Jeng KS,Sheen IS,Jeng WJ,et al.Blockade of the sonic hedgehog pathway effectively inhibits the growth of hepatoma in mice:An in vivo study[J].Oncol Lett,2012,4(6):1158-1162.

[6]Yu WW,Guo YM,Zhu M,et al.Clinicopathological and prognostic significance of EGFR over-expression in esophageal squamous cell carcinoma:a meta-analysis[J].Hepatogastroenterology,2011,58 (106):426-431.

[7]Arfaoui A,Kriaa L,Znaidi N,et al.Over-expression of EGFR is closely correlated to poor prognosis in Tunisian patients with non-small cell lung adenocarcinoma[J].J Immunoassay Immunochem,2014,35(3):256-268.

[8]Raymond E,Faivre S,Armand JP.Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase as a target for anticancer therapy[J].Drugs,2000,60 (Suppl 1):15-23.

2016-04-29)