張平，陳曉波，廖陳曾，李萬強，肖建華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼對前列腺癌細胞株DU145增殖和侵襲的影響

張平，陳曉波，廖陳曾，李萬強，肖建華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 DU145細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，融合達80%時用胰酶消化后傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，設(shè)空白對照組(用同體積培養(yǎng)基)、環(huán)靶明組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。

1.2.2 MTT法檢測細胞抑制率 細胞按5×103個/孔的密度接種于96孔板，孵育24 h后棄培養(yǎng)基，按分組加入相應(yīng)藥物(終濃度為環(huán)靶明2.5 μmol/L、吉非替尼10 μmol/L、環(huán)靶明2.5 μmol/L+吉非替尼10 μmol/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔，作用20 h時每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩溶解10 min后490 nm處測定各孔吸光度(A)值，抑制率=[(空白對照組A值-藥物組A值)/空白對照組A值]×100%。

1.2.3 細胞侵襲實驗 細胞經(jīng)胰酶消化后重懸，調(diào)整密度為4×105/mL，將經(jīng)過Matrigel膠包被制好的Transwell小室置入24孔板，取100 μL細胞懸液加入小室上層并按分組加入不同藥物(同1.3)，每組設(shè)6個復(fù)孔，另取600 μL含10%血清的培養(yǎng)基加入小室下層，孵育24 h后取出，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色，浸洗后揭膜并樹膠封片，隨機觀察6個視野(×200)，顯微鏡下計數(shù)平均穿膜細胞數(shù)。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達 將細胞懸液接種于10 cm培養(yǎng)皿中，按分組加入不同藥物(同1.3)，培養(yǎng)24 h。收集細胞加入RIPA裂解液，提取總蛋白并測定蛋白濃度，取等量蛋白上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)PVDF膜，牛奶封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色。取目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值用作半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，各組間比較采用Bonferroni t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 聯(lián)合用藥對DU145細胞增殖的影響 各藥物處理組細胞吸光度(A)值均低于空白對照組(P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組吸光度值低于環(huán)靶明(t=4.6487，P=0.001)和吉非替尼單藥組(t=6.024 5，P＜0.01，見圖1，表1)。環(huán)靶明、吉非替尼和聯(lián)合給藥組的抑制率分別為(43.16± 8.88)%、(35.97±11.26)%和(68.14±4.15)%。

表1 聯(lián)合用藥對DU145細胞生物學(xué)行為的影響(n=6,±s)

表1 聯(lián)合用藥對DU145細胞生物學(xué)行為的影響(n=6,±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與聯(lián)合用藥組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合用藥組比較，bP＜0.05。

組別 吸光度（A值） 穿膜細胞數(shù)（個）空白對照組吉非替尼組環(huán)靶明組聯(lián)合用藥組1.2103±0.1252 0.7726±0.1474ab0.6839±0.0989ab0.3842±0.0518a58.6667±8.6872 41.1667±6.3377ac39.5000±5.6480ac28.3333±3.3863a

圖1 聯(lián)合用藥對DU145細胞增殖的影響(吸光度值，n=6)

2.2 聯(lián)合用藥對DU145細胞侵襲的影響 各藥物處理組平均穿膜細胞數(shù)均小于空白對照組(P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組平均穿膜細胞數(shù)小于環(huán)靶明組(t= 3.067 7，P=0.036)和吉非替尼單藥組(t=3.525 6，P= 0.013，見圖2，表1)。

圖2 聯(lián)合用藥對DU145細胞侵襲的影響(×200，結(jié)晶紫染色，n=6)

2.3 聯(lián)合用藥后DU145細胞中SHH、PTCH和Gli-1蛋白表達的變化 環(huán)靶明組及聯(lián)合用藥組各通路蛋白的表達均低于空白對照組(P＜0.01)；吉非替尼組僅PTCH蛋白表達低于空白對照組(t=4.149 5，P=0.019)；聯(lián)合用藥組PTCH蛋白表達低于環(huán)靶明組(t=3.668 6，P=0.038)或吉非替尼單藥組(t=4.553 9，P=0.011，見圖3、表2)。

圖3 聯(lián)合用藥對DU145細胞中Hh通路蛋白表達的影響(相對表達量，n=3)

表2 聯(lián)合用藥對DU145細胞中Hh通路蛋白表達的影響(相對表達量，n=3,±s)

表2 聯(lián)合用藥對DU145細胞中Hh通路蛋白表達的影響(相對表達量，n=3,±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與空白對照組比較，bP＜0.05；與聯(lián)合用藥組比較，cP＜0.05。

組別空白對照組吉非替尼組環(huán)靶明組聯(lián)合用藥組SHH 0.9529±0.0979 0.9202±0.0726 0.5799±0.1080a0.5604±0.0857aPTCH 1.1112±0.1157 0.7531±0.1287bc0.6767±0.0815ac0.3601±0.0900aGil-1 0.9805±0.1147 0.9508±0.0855 0.6100±0.0879a0.5802±0.0914a

3 討 論

前列腺癌的發(fā)病率逐年增高，因為前期癥狀隱匿，相當(dāng)比例的患者就診時已進展至疾病晚期?，F(xiàn)行的綜合治療措施難以進一步提高晚期患者的生存質(zhì)量并降低死亡率，探索更有效的治療方案成為臨床亟待解決的熱點問題。目前針對特定信號通路的靶向藥物的研究為晚期前列腺癌的治療帶來新的選擇，并有望獲得突破性進展。

Hedgehog信號通路和酪氨酸激酶受體通路是與人體腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的兩條主要信號通路?；罨腍h通路蛋白SHH、PTCH及Gli-1等在多種人體腫瘤中表達異常[3-4]。環(huán)靶明作為特異性的Hh通路抑制劑，可通過下調(diào)Hh通路成員的蛋白表達，阻斷相應(yīng)的信號傳導(dǎo)而發(fā)揮抑癌作用[5]。腫瘤患者體內(nèi)也觀察到酪氨酸激酶受體通路的異?；罨?，以EGFR為代表的受體酪氨酸激酶在多種惡性實體瘤中過度表達[6-7]。吉非替尼作為EGFR酪氨酸激酶的高選擇性拮抗劑，可通過與ATP競爭EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點，抑制激酶活化而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[8]。

已有研究顯示環(huán)靶明和吉非替尼均可抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞的生長[1-2]。由于前列腺癌的惡性進展涉及多種分子途徑的異常調(diào)控，因此聯(lián)合應(yīng)用針對不同途徑的靶向藥物有可能獲得協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)，是否環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼作用于前列腺癌可獲得類似效應(yīng)，目前相關(guān)的報道有限。本實驗檢測了兩者聯(lián)合作用后前列腺癌細胞生物學(xué)行為的變化，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組的細胞增殖抑制率明顯高于單藥對照組，且聯(lián)合用藥較單一用藥更明顯地抑制了前列腺癌細胞的體外侵襲能力，結(jié)果表明環(huán)靶明聯(lián)合吉非替尼作用于前列腺癌可以獲得協(xié)同增強的抑癌效應(yīng)。本實驗進一步檢測了聯(lián)合用藥后Hh信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組PTCH蛋白的表達明顯低于單藥對照組，提示聯(lián)合用藥通過進一步下調(diào)PTCH的表達增強了對Hh通路的抑制作用，結(jié)果也提示聯(lián)合用藥獲得增強的抑癌效應(yīng)的機制可能與吉非替尼協(xié)同環(huán)靶明下調(diào)Hh通路的PTCH蛋白表達有關(guān)。本實驗為臨床探索晚期前列腺癌的靶向治療方案提供了新的思路。

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2016-04-29)