孔曉東，夏中元，周斌，孟慶濤

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060)

參附注射液對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌DJ-1表達(dá)的影響

孔曉東，夏中元，周斌，孟慶濤

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060)

目的 觀察參附注射液(SFI)對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷(IR)心肌DJ-1表達(dá)的影響，并探究其對(duì)糖尿病IR心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠腹腔注射60 mg/kg鏈尿佐菌素制備糖尿病模型。取糖尿病造模成功大鼠30只，隨機(jī)數(shù)字表法分為三組(n=10)：假手術(shù)組(S組)、IR組、IR+SIF組。心肌IR模型采用結(jié)扎冠脈左前降支(LAD)30 min后松開120 min制備，S組只穿線包繞LDA而不結(jié)扎。IR+SFI組開胸前SFI以10 mL·kg-1·h-1持續(xù)泵注，開胸后以3 mL·kg-1·h-1持續(xù)輸注至手術(shù)結(jié)束，其余兩組泵注等量晶體液。檢測(cè)SD大鼠心梗面積、血清肌酸激酶-MB(CK-MB)含量、心肌DJ-1表達(dá)，超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果與S組比較，IR組大鼠的心梗面積[(49.0±5.3)%vs(0.0±0.0)%]，CK-MB[(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L]、MDA[(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg]含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DJ-1表達(dá)[(0.65±0.14)vs(1.0±0.0)]和SOD活性[(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg]顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組相比，IR+SFI組大鼠的心梗面積[(35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%]，CK-MB[(1 364±228)U/L vs (1 982±275)U/L]和MDA[(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg]含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DJ-1表達(dá)[(0.9±0.14)vs(0.65±0.14)]和SOD活性[(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg]顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論SFI能顯著降低糖尿病心肌IR損傷的易損性，其機(jī)制可能與其上調(diào)心肌DJ-1表達(dá)、增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

參附注射液；心肌缺血再灌注損傷；糖尿病；DJ-1；氧化應(yīng)激

缺血性心臟病是糖尿病患者主要的心血管并發(fā)癥及首要的致死原因。循證醫(yī)學(xué)資料表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者一旦出現(xiàn)心肌缺血，其發(fā)生缺血再灌注(IR)損傷程度更重，預(yù)后更差，死亡率可達(dá)到非糖尿病患者的2～4倍[1]。DJ-1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型癌基因，研究顯示它在對(duì)抗機(jī)體氧化應(yīng)激方面扮演了十分重要的角色[2]，新近有證據(jù)表明，糖尿病心肌中DJ-1表達(dá)明顯下調(diào)，這可能是糖尿病IR心肌易損性增加的重要原因[3]。參附注射液(SFI)是根據(jù)我國古典配方提取的中醫(yī)急救藥物，研究發(fā)現(xiàn)SFI對(duì)損傷臟器具有保護(hù)作用，亦有學(xué)者表明，SFI在糖尿病IR心肌的保護(hù)方面發(fā)揮了重要作用[4]，但具體機(jī)制尚未完全闡述明確。本文擬觀察SFI對(duì)糖尿病IR心肌中DJ-1蛋白表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響，探討SFI減輕糖尿病IR心肌易損性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，8周齡(體質(zhì)量200～220 g)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ)、戊巴比妥鈉、TTC、伊文思藍(lán)(美國，Sigma公司)，參附注射液(SFI，三九藥業(yè))，肌酸激酶-MB(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢，Elabscience公司)，兔抗鼠DJ-1一抗(美國，CST公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁食12 h，采用腹腔單次注射STZ 60 mg/kg制備1型糖尿病大鼠模型，72 h檢測(cè)尾靜脈采血空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，之后每周檢測(cè)血糖一次。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房，采用普食喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 大鼠分組及給藥 糖尿病模型誘導(dǎo)成功8周后，取30只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為3組(n=10)：假手術(shù)組(S組)、IR組和IR+SFI組。IR+SFI組于開胸前經(jīng)股靜脈持續(xù)泵注SFI 10 mL·kg-1·h-1，開胸后改為3 mL·kg-1·h-1，其余兩組開胸前后持續(xù)泵注等量晶體液[4]。

1.4 心肌IR損傷模型的制備 腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定，行氣管切開插管術(shù)，接DW-2000型動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣。皮下心電監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸后暴露心臟，采用6-0結(jié)扎線包繞冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)根部。穩(wěn)定15 min后采用結(jié)扎LAD 30 min后松開結(jié)扎線再灌注120 min的方式制備心肌IR模型。LAD結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)為：心電圖ST段進(jìn)行性抬高，心尖變白，左室壁運(yùn)動(dòng)受限。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)為：ST段回落，心尖復(fù)紅。S組只穿線不結(jié)扎LAD。

1.5 心梗面積測(cè)定 再灌注結(jié)束后原位重新結(jié)扎LAD，股靜脈注入3%伊文思藍(lán)1 mL，待心臟充分染成藍(lán)色后迅速摘取心臟，立即置于-20℃下冷凍30 min，于特制凹槽內(nèi)沿心臟長軸方向?qū)⑵淝谐? mm薄片，置于1%TTC中37℃恒溫中染色15 min。正常心肌染成藍(lán)色，危險(xiǎn)區(qū)心肌磚紅色，梗死區(qū)心肌為白色。掃描，用Image-ProPlus6.0軟件計(jì)算缺血區(qū)和梗死區(qū)面積。

1.6 血清CK-MB檢測(cè) 再灌注結(jié)束時(shí)取右頸動(dòng)脈血2 mL，4℃離心取上清液，采用ELISA法檢測(cè)血清CK-MB水平。

1.7 心肌DJ-1表達(dá)測(cè)定 取左室組織，RIPA裂解液裂解，充分勻漿，于4℃離心15 min，取上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度。免疫印跡時(shí)加上樣緩沖液，煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，于兔抗鼠DJ-1抗體，GAPDH抗體4℃孵育過夜；于羊抗兔熒光二抗室溫孵育1 h；使用Odyssey紅外掃描顯影儀掃描并分析測(cè)定灰度值。

1.8 心肌SOD活性、MDA含量檢測(cè) 再灌注結(jié)束后，取左室組織，采用ELISA法檢測(cè)心肌SOD活性，MDA水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SFI對(duì)心梗面積和血清CK-MB的影響 與IR組比較，IR+SFI組心肌梗死面積顯著減小(P＜0.05)；IR組血清CK-MB含量顯著高于S組，但SFI能顯著降低IR組CK-MB含量(P＜0.05)，見表1。

2.2 SFI對(duì)心肌DJ-1蛋白表達(dá)的影響 與S組比較，IR組心肌DJ-1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與IR組比較，IR+SFI組心肌DJ-1蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，見表1和圖1。

圖1 SFI對(duì)糖尿病IR心肌DJ-1蛋白表達(dá)的影響

2.3 SFI對(duì)心肌SOD活性和MDA含量的影響 與S組比較，IR組心肌SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增加；而SFI能顯著增加IR心肌SOD活性，降低MDA含量(均P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心梗面積、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比較(n=6，±s)

表1 各組大鼠心梗面積、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比較(n=6，±s)

注：IR組心梗面積與IR+SIF組比較，t=3.99。與S組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05。

組別DJ-1蛋白S組IR組IR+SFI組F值P值心梗面積(%) 0.0±0.0 49.0±5.3 35.7±5.3b173.6＜0.000 1 CK-MB (U/L) 1076±261.7 1982±275.1a1364±228.0b16.39 0.000 4 1.0±0.0 0.65±0.14a0.90±0.14b13.04 0.001 SOD (U/mg) 143.1±15.4 79.0±19.3a119.4±14.6b19.17 0.000 2 MDA (nmol/mg) 7.6±1.1 13.1±1.9a7.3±1.2b24.43＜0.000 1

3 討 論

由于高血糖、高血脂以及活性氧自由基積聚，早期的糖尿病患者即可出現(xiàn)典型心肌病變，表現(xiàn)為心肌肥大、心臟舒張和收縮功能障礙等。此類患者一旦發(fā)生缺血性心臟病，其危害性和致死率遠(yuǎn)高于非糖尿病患者。本研究參照Xue等[5]的方法，采用腹腔注射STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，通過結(jié)扎LAD 30 min開放120 min的方法建立心肌IR模型，以完成后續(xù)研究。

SFI是紅參和附子的提取物，其主要有效成分包含人參皂甙和烏頭堿類。研究表明人參皂甙有較強(qiáng)的抗心肌IR損傷作用，且在動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究中得到了廣泛的證實(shí)，其機(jī)制可能涉及減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、清除氧自由基、抗脂質(zhì)氧化反應(yīng)、抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、改善缺血心肌組織微循環(huán)等。此外，SFI還具有降血糖等抗糖尿病的作用[6-7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SFI能顯著減少糖尿病IR心肌的梗死面積，降低血清CK-MB水平，提示SFI具備抗糖尿病心肌IR損傷的作用，這與我們及他人的前期研究相一致。

DJ-1(PARK7)是近年來細(xì)胞生物學(xué)和病理生理學(xué)等相關(guān)學(xué)科的重要發(fā)現(xiàn)，作為一種新型癌基因，它廣泛存在于人體的大腦、心臟、腎臟等臟器中。研究發(fā)現(xiàn)它編碼的DJ-1蛋白是一種多功能蛋白，在維持人體正常生理活動(dòng)及介導(dǎo)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了十分重要的作用[8]，近年來其抗氧化應(yīng)激的功能特性成為探討熱點(diǎn)。研究顯示，DJ-1可通過自身結(jié)構(gòu)和生化特異性、分子伴侶特性、胞核和線粒體穩(wěn)定性等對(duì)抗機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[8]。Taira等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1基因敲除后，細(xì)胞中與氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞毒性等有關(guān)的基因表達(dá)增高，細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的易損性增強(qiáng)。Liu等[3]在糖尿病大鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌DJ-1的表達(dá)較正常心肌明顯降低，這可能是糖尿病心肌氧化應(yīng)激水平增高的重要原因之一。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病IR心肌中DJ-1的表達(dá)更加減少，這與本研究的結(jié)果相一致。此外，我們研究顯示，SFI在增加糖尿病心肌對(duì)IR耐受性的同時(shí)，伴隨著心肌組織DJ-1的顯著上調(diào)，經(jīng)過對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，SFI能顯著增加心肌SOD活性，并降低心肌MDA含量。

綜上所述，SFI可有效地減輕糖尿病IR心肌的易損性，其機(jī)制可能與其上調(diào)心肌DJ-1蛋白表達(dá)，從而減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

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Effect of Shenfu injection on expression of DJ-1 in ischemia reperfusion myocardium of diabetic rats.

KONG Xiao-dong,XIA Zhong-yuan,ZHOU Bin,MENG Qing-tao.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Shenfu injection(SFI)on expression of DJ-1 in diabetic ischemia reperfusion(IR)myocardium,and explore the mechanisms of its cardioprotection.MethodsType 1 diabetes models were induced by a single intraperitoneal of 60 mg/kg streptozotocin in healthy male SD rats(weighing 200-220 g),and confirmed by fasting blood glucose≥16.7 mmol/L.Thirty diabetic rats were randomly assigned into 3 groups(n=10 each):sham group(S group),IR group and IR+SFI group.Myocardium IR model was established by occlusion of the anterior descending branch of left coronary artery(LAD)for 30 min followed by 120 min reperfusion. LAD was exposed but not occluded in S group.In IR+SFI group,SFI was continuously pumped into femoral vein with 10 mL·kg-1·h-1before opening chest,and after that,it was continuously pumped with 3 mL·kg-1·h-1.Crystal injection was pumped in parallel in the other two groups.After 120 min reperfusion,hearts were removed for determination of infarct size,DJ-1 expression,superoxide dismutase(SOD)activity and malonaldehyde(MDA)release.Blood was collected for creatine kinase-MB(CK-MB)assay.ResultsCompared with S group,larger myocardium infarct size,higher CK-MB and MDA release,lower DJ-1 expression and SOD activity were detected in IR group,(49.0± 5.3)%vs(0.0±0.0)%,(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L,(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg,(0.65±0.14)vs (1.0±0.0),(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg,P＜0.05.Compared with IR group,SFI significantly reduced myocardium infarct size,CK-MB and MDA release,and increased DJ-1 expression and SOD activity in IR+SFI group, (35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%,(1 364±228)U/L vs(1 982±275)U/L,(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg,(0.9± 0.14)vs(0.65±0.14),(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg,P＜0.05.ConclusionSFI can decrease the vulnerability of diabetic myocardium to IR injury.The mechanism is probably involving in DJ-1 activation,and then enhancing the ability of endogenous antioxidation.

Shenfu injection;Myocardianl ischemia reperfusion injury;Diabetes;DJ-1;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2016）20—3273—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.002

2016-05-14)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81471844)

夏中元。E-mail：xiazhongyuanmz@aliyun.com