高翔，陳廣謀，黃成碩，劉志軍，曾榮，楚佳奇，李鵬

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與細(xì)胞治療中心，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微創(chuàng)骨科研究室，廣東 湛江 524001)

·論 著·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損愈合的影響

高翔1，陳廣謀2，黃成碩2，劉志軍2，曾榮2，楚佳奇1，李鵬1

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與細(xì)胞治療中心，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微創(chuàng)骨科研究室，廣東 湛江 524001)

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松性的個(gè)體骨缺損愈合過程中的作用。方法采用全骨髓貼壁分離法培養(yǎng)原代BMSCs細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞儀檢測及使用成骨成脂特異性染色鑒定培養(yǎng)的BMSCs；選取60只雌性SD大鼠，通過肌注地塞米松(DEX，1 mg·kg-1·d-1)8周，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。所有大鼠經(jīng)手術(shù)于脛骨平臺(tái)下鉆孔造骨缺損模型，將大鼠隨機(jī)分成三組：對(duì)照組(NS組，骨折不處理)、DEX骨折+生理鹽水(NS)組、DEX+BMSCs組，將BMSCs注射到大鼠骨缺損部位治療(采用生理鹽水進(jìn)行對(duì)照)，于術(shù)后4周和8周，采用Micro-CT檢測各組大鼠的骨缺損愈合情況。結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞表型鑒定及成骨成脂特異性染色實(shí)驗(yàn)均證實(shí)分離得到的細(xì)胞是BMSCs。Micro-CT結(jié)果表明，與DEX+NS組比較，BMSCs細(xì)胞治療能促進(jìn)DEX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松性骨折的愈合。結(jié)論BMSCs對(duì)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松性大鼠的骨缺損具有顯著的促進(jìn)愈合作用，這為臨床治療繼發(fā)性骨質(zhì)疏松個(gè)體的骨損傷提供了一種新的研究思路。

SD大鼠；骨質(zhì)疏松；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨缺損

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶合成和分泌的一類甾體激素，由于其強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制等作用，在臨床治療中應(yīng)用十分廣泛，但是長期使用卻會(huì)引起骨量丟失，繼而導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)的發(fā)生[1]。有研究表明GIOP患者發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的兩倍[2]，并且骨折的風(fēng)險(xiǎn)與激素的使用呈劑量依賴性[3]。骨折是GIOP最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致殘疾，給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。GIOP患者的骨損傷(骨缺損或骨折)后愈合困難，目前對(duì)于此類患者的有效藥物治療較少，也存在易誘發(fā)腫瘤、價(jià)格昂貴等問題[5]。近年來，越來越多的學(xué)者關(guān)注利用干細(xì)胞強(qiáng)大的組織修復(fù)能力對(duì)骨質(zhì)疏松及骨損傷修復(fù)治療[6]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymalstem cells，BMSCs)是一種自我更新和多向分化能力的成體干細(xì)胞，是成骨細(xì)胞的源頭細(xì)胞，特定條件下，BMSCs可以向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而生成骨細(xì)胞發(fā)揮成骨作用[7]。此外，BMSCs具有易獲得、低免疫原性、可移植性、組織修復(fù)能力等生物學(xué)特性[8]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這些生物學(xué)特性為BMSCs在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，對(duì)治療骨質(zhì)疏松和修復(fù)骨缺損具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用全骨髓貼壁分離法體外分離大鼠BMSCs，通過利用BMSCs的干預(yù)治療來觀察BMSCs對(duì)治療骨質(zhì)疏松性大鼠骨缺損的影響，以期為BMSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 SPF級(jí)SD大鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；胰蛋白酶、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；茜素紅染液、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，油紅O染液(賽業(yè)生物，中國)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸(Sigma，美國)；PE標(biāo)記的大鼠來源的抗CD29、CD44、CD31、CD45、CD34、CD90及IgG(BD，美國)。

1.2 儀器設(shè)備 MEDI LINK雙能X線骨密度檢測儀(Osteospace，法國)；倒置顯微鏡(Leica，德國)；Micro-CT 40(Scanco，瑞士)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo，美國)；流式細(xì)胞儀(BD，美國)。

1.3 方法

1.3.1 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松性骨缺損模型的建立方法 選取雌性12周SD大鼠60只，隨機(jī)分為三組，每組20只，分別為對(duì)照組(NS組，骨缺損不處理)、DEX骨缺損+生理鹽水組(DEX+NS組)、DEX骨缺損+ BMSCs治療組(DEX+BMSCs組)。除對(duì)照組骨缺損不處理組外，其余兩組大鼠使用肌內(nèi)注射地塞米松1 mg·kg-1·d-1，3次/周，持續(xù)8周，建立GIOP模型，對(duì)照組骨折不處理組采用肌內(nèi)注射生理鹽水1 mL·kg-1·d-1作為對(duì)照，給藥方案與地塞米松造模相同。8周后檢測大鼠股骨骨密度，然后所有大鼠進(jìn)行雙側(cè)脛骨骨缺損手術(shù)：用低速骨鉆在大鼠脛骨平臺(tái)下外側(cè)鉆約2.0 mm的圓孔缺損，缺損應(yīng)達(dá)到骨髓腔，但不穿透對(duì)側(cè)皮質(zhì)，向骨髓腔中注射BMSCs(數(shù)量為1×106個(gè)/20μL)/生理鹽水20μL。骨缺損手術(shù)后進(jìn)行常規(guī)抗感染處理，肌內(nèi)注射1 000 000 U青霉素/只大鼠。大鼠術(shù)后第2天開始正常喂養(yǎng)，大鼠于術(shù)后第3天、第4周和第8周使用活體顯微CT成像系統(tǒng)觀察分析骨缺損愈合情況。

1.3.2 BMSCs原代分離及培養(yǎng) 選取4～6周SPF級(jí)SD大鼠，頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇消毒5～10 min后于超凈臺(tái)中取其兩側(cè)的股骨脛骨，并剪去上下兩端，暴露骨髓腔，用L-DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基輕輕吹打成單細(xì)胞懸液并接種

1.3.3 BMSC表面分子鑒定 選取P3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2～3次，1 000 r/min離心5 min后用PBS重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液分裝于離心管(EP管)中，每支EP管分別加入PE標(biāo)記的大鼠來源的抗CD29、CD44、CD31、CD45、CD34和CD90，對(duì)照組加入同型對(duì)照，混勻。室溫避光孵育30 min，離心棄上清，PBS洗去未標(biāo)記抗體，每管加入400μL PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BMSC鑒定。

1.3.4 BMSCs成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 選取P3代BMSCs接種于十二孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至細(xì)胞密度達(dá)到90%～100%時(shí)，分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基，每3 d換液一次，細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后，70%乙醇固定15 min，使用茜素紅進(jìn)行染色，而后用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 BMSCs成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 選取P3代BMSCs接種于十二孔板中，分別加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基，每3 d換液一次，細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定15 min，使用油紅O進(jìn)行染色，而后用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 骨密度檢測 大鼠肌注地塞米松或生理鹽水8周后，對(duì)大鼠股骨部位進(jìn)行骨密度掃描分析，確認(rèn)骨質(zhì)疏松造模是否成功。

1.3.7 Micro-CT法對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的檢測 術(shù)前、術(shù)后第3天、4周及8周分別對(duì)大鼠進(jìn)行骨微結(jié)構(gòu)掃描。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后固定于Micro-CT掃描管中，確定掃描范圍，沿骨長軸方向利用Micro-CT進(jìn)行掃描，掃描條件為：電壓70 kVp，電流114 μA，掃描分辨率2048×2048。選取感興趣區(qū)域和重建閾值：該實(shí)驗(yàn)選取大鼠脛骨手術(shù)部位為重建區(qū)域，重建閾值均為190，對(duì)所有掃描股骨的區(qū)域進(jìn)行三維重建。分析數(shù)據(jù)和圖片。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD44、CD29和CD90在BMSCs中高表達(dá)，陽性率分別為95.7%、99.7%和99.8%，而CD31、CD45、CD34低表達(dá)，陽性率僅為1.2%、0.8%和0.4%，見圖1。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況

2.2 BMSCs成骨和成脂誘導(dǎo)分化鑒定 BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)呈紅色(圖2A)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，油紅O染色可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多紅色脂滴并合并成串珠狀(圖2B)。

圖2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)情況

2.3 大鼠肌注DEX和NS前后骨密度的測定 大鼠通過肌注DEX來建立GIOP模型。肌注后大鼠股骨的骨密度顯著低于DEX肌注前和NS肌注后(圖3A)；Micro-CT分析結(jié)果也顯示與NS肌注后比較，DEX肌注后大鼠骨微結(jié)構(gòu)惡化，骨小梁厚量降低(圖3B)。結(jié)果證明GIOP模型建模成功。

2.4 SD大鼠繼發(fā)性骨質(zhì)疏松性骨缺損愈合情況 Micro-CT成像可用于反映骨痂的連續(xù)性和測量骨痂容積，礦化比例。與DEX+NS組比較，DEX+ BMSCs組在術(shù)后4周時(shí)顯示出更好的骨痂連續(xù)性；術(shù)后8周，DEX+BMSCs組骨缺損愈合處的骨小梁密度和粗細(xì)均一程度均高于DEX+NS組，骨缺損間隙的橋梁骨痂完全骨化，骨折端之間形成骨連接，與對(duì)照組恢復(fù)情況基本相同，提示重建修復(fù)情況良好(圖4)。

圖3 SD大鼠股骨骨密度(g/cm3)

圖4 Micro-CT檢測不同時(shí)間段各組大鼠骨缺損手術(shù)后愈合情況

3 討 論

本研究采用1 mg·kg-1·d-1地塞米松，3次/周，連續(xù)肌內(nèi)注射8周后，模型組大鼠骨密度顯著降低(P＜0.01)，骨微結(jié)構(gòu)惡化，骨小梁厚量降低，成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。本研究在骨質(zhì)疏松大鼠上進(jìn)行脛骨骨缺損手術(shù)力求模擬臨床上骨質(zhì)疏松患者的骨損傷。從最終顯微CT的分析結(jié)果可知，骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損后，其愈合過程較正常大鼠延遲大約4周。正常大鼠骨缺損僅需要4周時(shí)間，缺損部位基本修復(fù)完全，而骨質(zhì)疏松大鼠則需要8周時(shí)間才能基本完成缺損部位修復(fù)。

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporosis fracture，OPF)是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥[9]，因此OPF在治療及愈合過程除了單純的外科治療外更應(yīng)該需要重視骨質(zhì)疏松(OP)的治療[10]。糖皮質(zhì)激素(GC)長期使用引起骨質(zhì)疏松的主要原因之一是GC對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用[11]，GIOP患者由于成骨作用不足，在其發(fā)生骨損傷的情況下，成骨能力的不足造成骨骼愈合的緩慢。因此解決骨質(zhì)疏松患者骨損傷愈合延遲的關(guān)鍵在于提高患者的成骨作用。成骨細(xì)胞和成骨作用直接相關(guān)，成骨細(xì)胞增多或成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)均可提高成骨作用。

近年來，隨著組織工程學(xué)和細(xì)胞治療學(xué)的興起，干細(xì)胞移植治療OPF已成為研究熱點(diǎn)。因?yàn)楣撬杌|(zhì)干細(xì)胞是成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞，具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和成骨活性，可在細(xì)胞因子刺激下轉(zhuǎn)化成為成骨細(xì)胞，所以BMSC作為骨組織修復(fù)手段的研究日益增多。大量研究表明通過移植BMSCs來治療骨折后的骨不連癥狀，多數(shù)取得積極的效果[12]。Uejima等[13]將同種異體的BMSCs注射到去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的股骨髓腔中，可以顯著提高該區(qū)域的骨密度，增強(qiáng)生物力學(xué)強(qiáng)度。Takada等[14]在SAMP6模型鼠中注射同種異體骨髓至小鼠脛骨骨髓腔中，打破了破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的平衡，提高了骨組織細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，增加了該區(qū)域的骨密度。這些實(shí)驗(yàn)都證明可以用BMSCs移植手段來達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。

本實(shí)驗(yàn)通過采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs后，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，細(xì)胞表面抗原鑒定，以及使用茜素紅和油紅O染色鑒定的方法，確定本次研究所使用的細(xì)胞為BMSCs。采用制備的已鑒定的BMSCs對(duì)骨質(zhì)疏松性大鼠骨缺損進(jìn)行治療干預(yù)后，Micro-CT結(jié)果顯示，治療4周后，骨質(zhì)疏松性大鼠骨缺損部位已經(jīng)大部分愈合，所形成的骨痂明顯較生理鹽水對(duì)照組大鼠多，治療8周之后，DEX+BMSC組大鼠骨缺損愈合情況優(yōu)于NS組，BMSCs組骨折線完全消失，骨折間隙的橋梁骨痂完全骨化，骨折端之間形成骨連接，已進(jìn)入骨折端的塑形期，基本恢復(fù)正常骨骼形態(tài)，而DEX+NS組，骨痂尚未完全骨化，尚處于骨性愈合期。這些結(jié)果證明BMSCs可促進(jìn)骨痂的形成，加快骨損傷的愈合過程?；颊吖趋罁p傷時(shí)會(huì)觸發(fā)一系列響應(yīng)修復(fù)機(jī)制，調(diào)動(dòng)沉睡的成骨前體細(xì)胞、骨襯細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞啟動(dòng)骨骼修復(fù)，其中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞途徑是骨骼修復(fù)時(shí)成骨作用的重要來源。本實(shí)驗(yàn)通過治療干預(yù)增加骨折修復(fù)所需的BMSC，s可極大地提供額外的成骨修復(fù)作用，對(duì)抗GC的成骨抑制作用，加快骨損傷的修復(fù)進(jìn)程。

綜上所述，BMSCs的干預(yù)治療可顯著改善GIOP骨折股骨骨密度，加速骨折愈合時(shí)間，為BMSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。隨著研究的不斷深入，基質(zhì)干細(xì)胞未來將為臨床骨損傷的治療提供一種新的途徑。

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Effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on bone defect healing in rats with secondary osteoporosis.

GAO Xiang1,CHEN Guang-mou2,HUANG Cheng-shuo2,LIU Zhi-jun2,ZENG Rong2,CHU Jia-qi1,LI Peng1.1.Stem Cell Research and Cellular Therapy Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA;2.Department of Orthopedic Surgery,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo assess the therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs)in bone defect healing in rats with secondary osteoporosis.MethodsPrimary BMSCs were cultured by whole bone marrow adherence method,and the BMSC was detected and identified by flow cytometry and osteogenic specific staining.Sixty female SD rats were selected and injected intramuscularly of dexamethasone(DEX,1 mg·kg-1·d-1)for 8 weeks to establish rat models of osteoporosis.Then the rats were drilled under the tibial plateau to establish bone defect models.The rat models were randomly divided into three groups,control group NS group(fracture was not treated), DEX fracture combined with saline(DEX+NS group),DEX fracture combined with BMSCs treatment group(DEX+ BMSCs group).BMSCs were injected into the bone defect site for treatment(saline was used as control).Micro-CT was used to detect bone defect healing of the rats in each group 4 and 8 weeks after surgery.ResultsFlow cytometry and osteogenic specific staining both confirmed that the isolated cells were BMSCs.Micro-CT results showed that BMSCs treatment can promote the healing of osteoporotic fracture induced by DEX,compared with DEX fracture combined with NS.ConclusionBMSCs has a significant role in promoting the healing of bone defect in secondary osteoporotic rats,which provides a new approach for clinical treatment of individual bone defect in the patients with secondary osteoporosis.

Sprague-Dawley rat;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells(BMSCs);Bone defect

R-332

A

1003—6350（2016）20—3269—04

2016-05-10)

廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào)：S2013020012866)；廣東省湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014A06005)；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金面上培育項(xiàng)目(編號(hào)：M2014048、M2015013)

李鵬。E-mail：lipeng5155703@163.com