馬珍元，黃呈輝，張新枝，鐘世良，田建華（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院，廣東深圳518101）

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2014年深圳市流行的1型登革病毒分子溯源分析*

馬珍元，黃呈輝，張新枝，鐘世良，田建華
（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院，廣東深圳518101）

摘要：目的對2014年深圳市登革熱（DF）流行時(shí)分離的登革熱1型病毒株（DENV-1）進(jìn)行E基因序列測定，了解其分子病毒學(xué)特征，探討其可能來源。方法收集35份2014年深圳市DF患者急性期血清標(biāo)本，用乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）分離DF病毒，并用逆轉(zhuǎn)錄-半套式聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）反應(yīng)對其進(jìn)行型別鑒定。RT-PCR擴(kuò)增全長E基因，測序并進(jìn)行同源性與進(jìn)化樹分析。結(jié)果35份血清樣本中分離到DENV-1 21株。選取6株深圳DENV-1分離株測序，E基因全長1 485 bp，編碼495個氨基酸。6株深圳市DENV-1分離株同源性為100.0%，其同源性與深圳市2010流行株接近，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.5%和99.8%，與新加坡2009和日本2004流行株的核苷酸和氨基酸同源性最高達(dá)99.7%和100.0%。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，深圳6株DENV-1屬于基因型1型，與Shenzhen2010、Singpore2009、Japan2004的親緣關(guān)系較近，在同一進(jìn)化支上。結(jié)論2014年深圳市DENV-1屬GⅠ亞型，最可能來源于東南亞一帶，于2010年本地化而引起2014年DF流行。

關(guān)鍵詞：登革熱；登革熱病毒；E基因；序列測定；系統(tǒng)進(jìn)化樹

登革熱（dengue fever，DF）是由登革病毒（dengue virus，DENV）引起的一種嚴(yán)重的急性蟲媒傳染病。近十年來，登革熱在全世界的發(fā)病率提高近30倍，波及全球100多個國家和地區(qū)，成為世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。在我國，登革熱主要流行于廣東、海南、廣西、福建、臺灣等南方及東南沿海省份。深圳自成立經(jīng)濟(jì)特區(qū)以來，2001年報(bào)告首例輸入性登革熱病例，之后不斷有散在輸入性病例報(bào)告，主要來源于周邊城市及東南亞國家。2010年10月深圳市福田某工地上發(fā)生首起本地登革熱暴發(fā)流行，流行規(guī)模以局部低強(qiáng)度流行為主[2]。2014年9月-2014年12月深圳再次發(fā)生本地登革熱暴發(fā)流行，全市共報(bào)道確診病例454例，流行規(guī)模較2010年明顯擴(kuò)大。為分析2014年DENV流行株的可能來源，本研究對2014年深圳市登革熱暴發(fā)流行期間分離的部分登革熱1型病毒株進(jìn)行E基因序列測定和分子進(jìn)化分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

選取2014年登革熱暴發(fā)流行期間在本院感染科住院的35例患者。參照衛(wèi)計(jì)委2014年制定的登革熱診療指南（第二版）[3]，所有入選患者為登革熱確診病例，其中男性20例，女性15例，年齡15～83歲，平均年齡41.3歲。收集患者急性期血清，4℃、3 000 r/min（離心半徑5 cm），低速離心5 min分離血清，置于-70℃冰箱冷凍保存。

1.2病毒培養(yǎng)分離及RNA提取

采用乳倉鼠腎細(xì)胞-21（baby hamster syrian kidey，BHK-21）分離患者血清樣本中登革病毒。BHK-21細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈。35份血清樣本用維持液1∶10稀釋后，接種至培養(yǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞，37℃吸附1 h后棄上清液，加入適量維持液，置37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況并拍照，6 d后傳代。以出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)殛栃?，盲?代無細(xì)胞病變則為陰性。待＞75%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收取病毒。采用大連寶生生物工程有限公司的病毒RNA提取試劑盒提取分離株RNA。取陽性培養(yǎng)液上清200μl，加入200μl裂解緩沖液、20μl蛋白酶K和1.00μl Carrier RNA，56℃水浴10 min。加入200μl無水乙醇，充分混勻后移至核酸純化柱中，離心后棄濾液，洗脫緩沖液洗脫病毒RNA，溶于50μl去離子水，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病毒核酸檢測和型別鑒定

參照Lanciotti等[4]所報(bào)道的方法，采用逆轉(zhuǎn)錄-半套式聚合酶鏈（reverse transcziption-polymerase chain reaction，RT-PCR）反應(yīng)進(jìn)行登革病毒核酸檢測及亞型鑒定，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4RT-PCR擴(kuò)增E基因

參考已報(bào)道的DENV-1（GenBank登錄號：AF309641）基因組序列，用Primer 3.0分別設(shè)計(jì)合成2對DENV-1的E基因擴(kuò)增測序引物，引物序列為：DENV-1-E-正向引物1：5′-GCGTTCCATTTGA CTACACGATGG-3′，DENV-1-E-反向引物1：5′-AT GGTGTTGTTGACAATGAAAGC-3′，目標(biāo)產(chǎn)物長度為1 108 bp；DENV-1-E-正向引物2：5′-CAGTAAT AGTCACCGTCCACA-3′，DENV-1-E-反向引物2：5′-GTTGTAGGAGATGTTGCTGGGAT-3′，目標(biāo)產(chǎn)物大小為1 234 bp，片段可完全覆蓋E基因區(qū)域。采用大連寶生生物工程有限公司二步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測。第一步將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：取3μl病毒RNA作為模板，加入隨機(jī)的6核苷酸引物、4種脫氧核苷三磷酸混合液，無RNA酶水補(bǔ)足到10μl，65℃保溫5 min后4℃冷卻進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，在上述反應(yīng)液中依次加入RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、5×緩沖液，無RNA酶水補(bǔ)足到20μl，于30℃、10 min，42℃、30 min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃、5 min 后4℃冷卻，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。第二步進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)液組成：10×PCR緩沖液5μl、4種脫氧核苷三磷酸混合物（各10 mmol）2μl、Taq DNA聚合酶（5 u/μl）0.5μl、正向引物和反向引物（10μmol）各0.5μl、逆轉(zhuǎn)錄液5μl，無RNA酶水補(bǔ)足到50μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。用Tris-硼酸緩沖液配制含0.5μg/ml溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠，取5μl PCR產(chǎn)物，與1μl上樣緩沖液混和，在Tris-硼酸緩沖液中以80 V恒壓電泳1 h，在透射式紫外分析儀上觀察，并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果條帶的分子質(zhì)量與預(yù)期片段大小相同，則判斷為陽性結(jié)果。

1.5序列測定和拼接

PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司純化后進(jìn)行正、反向測序。測序完成后，將測序結(jié)果分別用美國生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站提供的在線軟件進(jìn)行序列分析，確認(rèn)無誤后，各片段序列采用DNA Star軟件中的SeqMan拼接成完整的E基因序列。

1.6基因序列的同源性和進(jìn)化分析

利用NCBI BLASTn對GenBank基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，并利用Clustalx（1.83）軟件進(jìn)行同源性比較。用MEGA 4.1的鄰接法（Neighbor-Joining）完成系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。模型采用Kimura 2-Parameter model，Bootstrap值設(shè)定為1 000。

2　結(jié)果

2.1DENV分離培養(yǎng)結(jié)果

用BHK-21細(xì)胞對35份血清樣本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，其中21份標(biāo)本出現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓、空泡結(jié)構(gòu)（見圖1）。病毒分離陽性率為60.0%。

2.2RT-PCR反應(yīng)鑒定DENV型別

對21份陽性培養(yǎng)液上清提取病毒RNA后，用RT-PCR反應(yīng)檢測登革病毒核酸并鑒定型別，通用引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增后，21株分離株可擴(kuò)增出511 bp片段，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的大小吻合。將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，獲得482 bp DENV-1型特異性條帶，陰性對照未見任何條帶。見圖2。

圖1　BHK-21細(xì)胞分離培養(yǎng)DENV結(jié)果（×200）

圖2　DENV-1 RT-PCR反應(yīng)分型檢測及E基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖3　2014年深圳市6株DENV-1型E基因推導(dǎo)的氨基酸同源性分析

2.3DENV-1型E基因的RT-PCR擴(kuò)增及序列測定

選取癥狀典型、發(fā)病時(shí)間早、發(fā)病地點(diǎn)不同的6株分離株進(jìn)行E基因擴(kuò)增，所有標(biāo)本在1000～2000bp出現(xiàn)明顯目的條帶（見圖2）。經(jīng)測序及拼接后顯示，所有分離株E基因全長1 485 bp，推導(dǎo)編碼495個氨基酸，未發(fā)現(xiàn)序列插入或缺失，核苷酸差異廣泛分布于整個序列。

2.4DENV-1型E基因同源性分析

6株深圳DENV-1分離株E基因核苷酸同源性為100.0%，推導(dǎo)的495個氨基酸序列亦完全一致（見圖3）。將2014年深圳市DENV-1分離株與國內(nèi)30年來部分年份DENV-1流行株進(jìn)行E基因同源性比較（見附表），結(jié)果顯示，深圳市DENV-1分離株與國內(nèi)2010、2007和2004年份分離到的Shenzhen2010（JN029813）、Zhuhai2007（EU359008）、Fujian2004（DQ193572）流行株同源性較高，核苷酸同源性在98.9%～99.5%，氨基酸同源性為99.4%～100.0%，尤其與Shenzhen2010（JN029813）的同源性最高，核苷酸及氨基酸同源性分別為99.5%和99.8%；與其他國家分離到的DENV-1毒株，如Singpore2014（KJ806961）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2004（EU069606）、Japan2004（AB178040）有很高的相似性，與這些毒株在該區(qū)域的核苷酸同源性最高達(dá)99.7%，氨基酸同源性最高達(dá)100.0%。6株深圳市DENV-1分離株與上述DENV-1型毒株E蛋白區(qū)氨基酸序列相似，均各有2個糖基化位點(diǎn)，分別位于E蛋白區(qū)的第67～70和153～156位，E蛋白相關(guān)毒力位點(diǎn)E（44）、E（156）、E（366）處均無變異。

2.5E基因進(jìn)化分析

圖4　2014年深圳市DENV-1分離株E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

附表　2014年深圳市DENV-1分離株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較　%

為進(jìn)一步分析深圳D1分離株的進(jìn)化關(guān)系，筆者將6株深圳DENV-1分離株的E基因序列與基因庫中下載的世界其他流行區(qū)分離株的序列相比對，并繪制基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖4）。40株登革1型毒株被分成4個基因亞型，分別對應(yīng)Goncalvez等[10]的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ基因型。6株深圳市DNEV-1分離株位于基因型Ⅰ型進(jìn)化支上，與Shenzhen2010 （JN029813）、Fujian2004（DQ193572）、Singpore2009 （JF960216）、Japan2004（AB178040）親緣關(guān)系較近，位于同一分支內(nèi)。

3　討論

登革病毒根據(jù)抗原性不同分為4個血清型，分別為DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4，依據(jù)病毒E基因不同又可以分成不同基因亞型（genotype）GⅠ～GⅤ，不同的地理區(qū)域流行著不同的血清型和基因亞型[5，12]。廣東省以DENV-1為主要流行的血清型，其中優(yōu)勢基因亞型為GⅠ亞群，少數(shù)為GⅣ亞群[6-7]。通過測定病毒核酸或蛋白序列，比較分析序列間的同源性和進(jìn)化關(guān)系，從分子水平追蹤傳染源，對病原進(jìn)行溯源，是目前病毒分子流行病學(xué)調(diào)查的主要手段之一。由于登革病毒包膜蛋白由E基因所編碼，位于病毒顆粒表面，構(gòu)成顆粒的突起，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白。其決定病毒的組織親嗜性，并介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合[8]，同時(shí)還是影響毒力，誘導(dǎo)特異性的保護(hù)性中和抗體及免疫病理損傷的重要成分[9]。因此，E基因是分析登革病毒基因亞型、病毒變異與進(jìn)化的最適片段。

本研究中6株DENV-1分離株E基因全長為1 485bp，編碼495個氨基酸，未見序列插入或缺失。6株病毒分離株E基因同源性達(dá)100.0%，表明雖然深圳DENV-1分離株的樣本來源不同，即患者不同、發(fā)病時(shí)間不同、發(fā)病地點(diǎn)不同，但是分離株為同一性狀的登革1型病毒，即6例患者為同一毒株感染引起的子代患者。結(jié)合患者流行病學(xué)資料分析，6例患者為深圳市居民。所有患者在發(fā)病前1個月在深圳市居住，無輸血史、無外出史，缺乏輸入性感染的依據(jù)。因此可以判斷6株深圳市DENV-1分離株為2014年深圳市本地流行株。

E基因同源性分析顯示，2014年深圳市DENV-1分離株與國內(nèi)2010、2007和2004年份分離到的流行株同源性較高；與其他國家流行的DENV-1分離株在該區(qū)域的同源性比較，相似性較高的主要是新加坡和日本等地流行株。2002年，Goncalvez等[10]利用DENV-1全長E蛋白編碼基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將世界各地分離的44株DENV-1分離株分為5個基因型：Ⅰ型，以HAWAII/1945分離株為代表；Ⅱ型，以泰國20世紀(jì)50、60年代分離株為代表；Ⅲ型，只有Sylvatic株；Ⅳ型，包括West Pacific株、Austria分離株；V型，主要包括美洲一些分離株。將本次疫情中分離到的6株深圳DENV-1分離株與其他DENV-1型病毒分離株進(jìn)行比較，根據(jù)E蛋白編碼基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，6株深圳DNEV-1分離株位于GⅠ亞群進(jìn)化支上，與Shenzhen2010（JN029813）、Fujian2004（DQ193572）、Singpore2009（JF960216）、Japan2004（AB178040）親緣關(guān)系較近。

為進(jìn)一步揭示深圳市登革熱流行病學(xué)概況，本實(shí)驗(yàn)將2014年6株深圳DENV-1分離株與2010年深圳DENV-1分離株比較發(fā)現(xiàn)，兩者高度同源且進(jìn)化距離相當(dāng)接近，傳播鏈時(shí)隔4年，提示本次流行的DENV-1與2010年流行株關(guān)系密切，因此筆者推測2010年流行株本地化并引起2014年登革熱流行的可能性。無論從E基因的核苷酸序列還是氨基酸序列來看，2010和2014年深圳市分離株都是與新加坡2008、2009、2010、2013和2014年份分離到的Singpore2008（GQ357687）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2010（JF960223）、Singpore2013（KJ806949）、Singpore2014（KJ806961）流行株最為接近，而該5株新加坡分離株之間核苷酸同源性為99.1%～99.8%，氨基酸同源性為99.6%～100.0%，可以認(rèn)為是同一來源的分離株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Singpore2008 （GQ357687）、Singpore2009（JF960216）、Singpore2010 （JF960223）、Singpore2013（KJ806949）、Singpore2014 （KJ806961）與Singpore2004（EU069606）有極高的相似性，核苷酸及氨基酸序列的同源性＞99.5%；而Singpore2004（EU069606）與Japan2004（AB178040）高度相關(guān)，兩者同源性達(dá)99.9%。因此筆者推斷，2010和2014年深圳DENV-1流行株是輸入性的，極有可能是Japan2004（AB178040）（由密克羅尼西亞傳人日本），于2004年由日本傳入中國的福建、廣東及新加坡，之后該毒株一直在新加坡和中國循環(huán)，并傳入深圳市，在深圳市發(fā)生獨(dú)立進(jìn)化，于2010和2014年引起深圳市本地暴發(fā)流行。

理論上，一個地區(qū)連續(xù)發(fā)生輸入性病例與本地暴發(fā)流行，加上人口增長及流動性增加等因素，可能使其從無DF流行地區(qū)（無病毒存在）變?yōu)榈偷胤叫粤餍袇^(qū)（一種血清型別流行）和高地方性流行區(qū)（多種病毒血清型別流行）[11-12]。深圳市作為中國的窗口城市，處于登革熱流行地區(qū)的包圍中，國內(nèi)外交往和人口流動頻繁，輸入性病例不斷增加；地處亞熱帶，氣候溫暖潮濕，雨量充沛，利于蚊媒孳生，并且探明存在傳播媒介白紋伊蚊[13]。此外，對深圳市16～60歲健康人群登革熱抗體水平調(diào)查中，檢測到登革病毒IgG抗體陽性率為4.3%，從而證實(shí)登革熱隱形感染的存在[14]。特別是2010年深圳市福田報(bào)道首起本地登革熱暴發(fā)流行，客觀上說明深圳市地區(qū)已存在登革熱流行條件。而2014年深圳市登革熱再次出現(xiàn)本地流行，更應(yīng)該引起疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的警惕，盡早做好各項(xiàng)防控措施，阻止深圳市轉(zhuǎn)變?yōu)榈歉餆岬闹械鹊胤叫粤餍袇^(qū)，甚至高等地方性流行區(qū)。

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（童穎丹編輯）

臨床論著

Molecular phylogenetic analysis of type 1 strains of dengue virus isolated in Shenzhen City during the 2014 dengue outbreak*

Zhen-yuan Ma, Cheng-hui Huang, Xin-zhi Zhang, Shi-liang Zhong, Jian-hua Tian
(The Affiliated Shenzhen Baoan Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518101, China)

Abstract:Objective To determine the envelope (E) gene sequence of type 1 dengue virus (DENV-1) isolated in Shenzhen in 2014, and to understand the molecular virology characteristics of these strains as well as to explore their possible origin. Methods Thirty-five serum samples were collected from patients with dengue fever. Dengue virus was isolated by BHK-21 cells and the serotypes were detected by semi-nested polymerase chain reaction (PCR). The E gene of the isolated strains was amplified by RT-PCR and sequenced. Homological and phylogenetic trees were also constructed based on the E gene of isolated dengue virus strains. Results Totally 21 strains were isolated from 35 samples and identified as type 1 dengue virus. The complete coding region of E genes from 6 strains of DENV-1 was all composed of 1,485 nucleotides which encoded 495 amino acids. Nucleotide sequence homology of 6 strains of DENV-1 was 100.0%identical, and their homology was very similar to the epidemic strains of DENV-1 virus in Shenzhen in 2010. The homology of the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence was 99.5% and 99.8%respectively. Compared with epidemic DENV -1 strains isolated from other countries, DENV-1 from Shenzhen in 2014 was close to the strains isolated in Singpore and Japan, and the highest homology of their E genes and the deduced amino acids was 99.7% and 100.0%. The phylogenetic tree of E genes indicated that the 6 strains of DENV-1 had the greater similarity with Shenzhen2010, Singpore2009 and Japan2004; and they all belonged to the genotype GⅠ. Conclusions DENV-1 strains from Shenzhen in 2014 belonged to thebook=40,ebook=46genotype GⅠ. They most likely originated from Southeast Asian countries. These epidemic dengue virus strains had been settled down in Shenzhen in 2010 and caused 2014 dengue fever outbreak.

Keywords:dengue fever; dengue virus; Egene; sequencing; phylogenetic tree

[通信作者]黃呈輝，E-mail：hchuisz@126.com

*基金項(xiàng)目：深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：2015253）

收稿日期：2015-08-14

文章編號：1005-8982（2016）03-0039-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.008

中圖分類號：R512.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A