高磊，何國平，錢億超，戚傳平

· 論著 ·

急性冠脈綜合征患者血小板反應蛋白-1基因多態(tài)性分析

高磊1，何國平1，錢億超1，戚傳平2

目的研究中國人群血小板反應蛋白-1（TSP-1）基因A2210G（N700S）多態(tài)性與急性冠脈綜合征（ACS）的相關性。方法采用病例-對照研究，入選2005年6月～2010年11月在江蘇大學附屬武進醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院住院的412例ACS患者及同期337例非冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┱咦鳛閷φ战M，應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析的方法檢測TSP-1 A2210G多態(tài)性，采用logistics回歸分析TSP-1基因多態(tài)性分布與ACS的相關性。結(jié)果TSP-1基因A2210G多態(tài)性AG基因型在ACS組和對照組的分布無顯著性差異（1.5% vs. 0.6%，P=0.43），未檢測到GG純合子。G等位基因頻率在ACS組和對照組分別為0.7%、0.3%（P=0.43）。多元Logistic回歸分析顯示，TSP-1基因AG基因型與ACS無顯著相關性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。結(jié)論TSP-1基因700N→S變異在中國人群中發(fā)生頻率低，且與ACS的發(fā)病無顯著相關性。

血小板反應蛋白；基因多態(tài)性；急性冠脈綜合征

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑囊环N嚴重類型，是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，包括急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死及不穩(wěn)定型心絞痛。ACS最主要的發(fā)病機制是不穩(wěn)定斑塊破裂或糜爛和繼發(fā)血栓形成。在被AHA評為當年十大研究進展之一的GeneQuest研究中，Topol等[1]發(fā)現(xiàn)血小板反應蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）基因多態(tài)性A2210G（N700S）在冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成過程中起著重要的作用，與急性心肌梗死的危險性顯著相關。本研究旨在探討TSP-1 N700S多態(tài)性與中國人群ACS的可能關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象入選病例來源于2005年6月～2010年11月在江蘇大學附屬武進醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院的心內(nèi)科住院患者。其中ACS組412例，疾病診斷標準為2002年AHA/ACC關于ACS的診斷指南，其中男性298例，女性114例，平均年齡（65.24± 10.95）歲。對照組337例，其中男性232例，女性105例，平均年齡（63.66±11.76）歲，經(jīng)檢查排除冠心病。所有病例均為中國人群，并排除惡性腫瘤、心肌病、先心病及嚴重肝病和腎病等。

1.2 研究方法采集外周靜脈血約2 ml，分離出白細胞，以酚-氯仿法提取基因組DNA。PCR擴增體系總體積為50 μl，包括10×緩沖液5 μl、上下游引物各20 pmol、4種dNTP終濃度為0.2 mmol/ L、Mg2+終濃度為2.0 mmol/L、DNA模板100 ng和Taq DNA酶1.25 U。上游引物為5′-AAGAACGC CAAGTGCAACTAC-3′，下游引物為5′-AGAGCTAGCCCTGTTCATGTT-3′。PCR反應條件：先95℃預變性5 min，然后按95℃ 40 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s進行33個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，UVI自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ于65℃消化約12 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。進一步抽取部分PCR擴增產(chǎn)物進行測序鑒定。

1.3 統(tǒng)計學分析用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（s）表示，使用t檢驗比較。計數(shù)資料用例數(shù)（構成比）表示，使用χ2檢驗比較。關聯(lián)程度用優(yōu)勢比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）表示，使用logistic回歸分析計算。以P＜0.05為統(tǒng)計學差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較ACS組和對照組在年齡、性別、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等方面比較，差異無顯著性意義（P＞0.05）。ACS組吸煙率、高血壓和糖尿病比例、空腹血糖（FPG）、收縮壓（SBP）及三酰甘油（TG）水平明顯高于對照組，而低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯低于對照組（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 TSP-1基因型分析PCR擴增產(chǎn)物為360 bp的片段，如果存在等位基因G，當用內(nèi)切酶BsrⅠ酶切后可產(chǎn)生240和120 bp 兩條片段。本研究檢測到兩種基因型（圖1）：AA基因型（360 bp）和AG基因型（360，240和120 bp），未檢測到GG基因型。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序進一步驗證（圖2）。

圖1 TSP-1不同基因型PCR產(chǎn)物酶切電泳圖 [1：DNA Marker；2、3、4、6：AA基因型（360 bp）；5：AG基因型（360、240和120 bp）]

圖2 PCR產(chǎn)物測序圖（A部分顯示為AA基因型，箭頭提示該位點呈A/A單峰；B部分顯示為AG基因型，箭頭示該位點呈A/G雙峰）

2.3 TSP-1基因多態(tài)性分布及其與ACS的關系研究結(jié)果顯示，TSP-基因AG基因型頻率在ACS組和對照組分別為1.5%和0.6%（P=0.43），G等位基因頻率在兩組間的分布也無顯著性差異（0.7% vs. 0.3%，P=0.43）（表2）。Logistic回歸分析顯示，調(diào)整吸煙、高血壓、糖尿病、TG及HDL-C等因素后，TSP-1基因AG基因型與ACS無顯著相關性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。

3 討論

TSP-1是一種多結(jié)構域及多功能的細胞外基質(zhì)糖蛋白，可由激活的血小板α顆粒、單核細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞等合成分泌，參與調(diào)節(jié)平滑肌增值與遷移、內(nèi)皮細胞凋亡、血小板聚集、血栓形成及血管新生等生物學過程[2-5]。TSP-1在ACS動脈粥樣硬化的形成及損傷過程中發(fā)揮重要作用，其遺傳多態(tài)性對動脈壁中的重要事件具有潛在意義[6,7]。

TSP-1基因定位于15號染色體q15，編碼1170個氨基酸，包括21個外顯子。其多態(tài)性位點A2210G位于第13外顯子，該位點上發(fā)生A→G堿基改變，從而導致蛋白鏈的第700位氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸（700N→S）。GeneQuest研究中，Topol等[1]發(fā)現(xiàn)TSP-1 N700S多態(tài)性與早發(fā)心肌梗死的危險性顯著相關。有學者進一步研究表明，TSP-1蛋白第700位氨基酸N→S替代可引起其鈣結(jié)合域?qū)︹}離子的親活力下降，進而增加了TSP-1致血小板聚集和釋放功能，這可能是其促進心肌梗死發(fā)生的可能機制[8]。而之后日本、荷蘭等人群的研究卻未能重復GeneQuest研究結(jié)果，TSP-1 N700S變異在不同種族人群中的分布差異很大[9-12]。本研究表明TSP-1 N700S不是中國人群常見的單核苷酸多態(tài)性位點，700N→S變異頻數(shù)明顯低于西方人群（0.3% vs. 11%）[5]，且未發(fā)現(xiàn)其與ACS的發(fā)生顯著相關。各研究報道不一致可能與以下因素有關，如研究人群種族不同、遺傳背景差異、對象納入標準差異以及環(huán)境因素影響等。當然，本研究的設計和方法亦有一些局限性，如樣本量偏小，且未進行TSP-1功能學研究。

表2 TSP-1 A2210G基因型和等位基因頻率的分布

綜上所述，不同種族人群的TSP-1 N700S多態(tài)性分布差異較大，中國人群700N→S變異發(fā)生率明顯低于西方人群，且與ACS發(fā)病無顯著相關性。本研究結(jié)果進一步補充了冠狀動脈疾病TSP-1基因數(shù)據(jù)庫信息。TSP-1 N700S多態(tài)性與ACS的確切聯(lián)系尚需從多個不同的大規(guī)模人群進一步探討。

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本文編輯：劉璐鑫，田國祥

Polymorphism of thrombospondin-1 gene in patients with acute coronary syndrome

GAO Lei*, HE Guoping, QIAN Yi-chao, QI Chuan-ping.*Department of Cardiology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China.

GAO Lei; E-mail: gaolei801201@sina.com

ObjectiveTo analyze the correlation between polymorphism of the thrombospondin-1 (TSP-1) gene A2210G (N700S) and acute coronary syndrome (ACS) in the Chinese population.MethodsA case-control study was conducted. By polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis, the TSP-1 A2210G polymorphism was analyzed in 412 patients with ACS (ACS group) and 337 control subjects free from coronary artery disease (control group) from Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University between June 2005 and November 2010.ResultsThe frequencies of AG genotype were 1.5% and 0.6% in ACS group and control group, respectively (P=0.43). None of the homozygotes were detected for the G allele. The prevalence of the G allele was not significantly different between ACS group and control group (0.7% vs. 0.3%, P=0.43). Result of multivariate logistic regression analysis showed that AG genotype of TSP-1 gene had no significant correlation with ACS (OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46).ConclusionThe TSP-1 N700S variant shows a low prevalence in the Chinese population and fails to associate with an altered risk of ACS.

Thrombospondin; Genetic polymorphism; Acute coronary syndrome

R541.4

A

1674-4055(2016)12-1449-03

常州市衛(wèi)生局重大科研項目(ZD200601)

1213002 常州,江蘇大學附屬武進醫(yī)院心內(nèi)科;2213002 常州,江蘇大學附屬武進醫(yī)院檢驗科

高磊,E-mail:gaolei801201@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.10