邊振宇 王 磊 李茂強(qiáng) 王雪鵬 朱六龍

復(fù)方丹參注射液對兔壓迫性頸髓損傷減壓術(shù)后療效影響的實(shí)驗(yàn)研究

邊振宇 王 磊 李茂強(qiáng) 王雪鵬 朱六龍

目的探討復(fù)方丹參注射液對壓迫性頸髓損傷減壓后繼發(fā)性缺血再灌注損傷干預(yù)作用。方法雄性新西蘭白兔24只，隨機(jī)分為壓迫組、復(fù)方丹參+減壓組、減壓組和正常對照組，每組6只。除正常對照組外，余三組建立兔頸髓壓迫損傷動物模型。復(fù)方丹參+減壓組在減壓術(shù)前及術(shù)后給予靜脈注射復(fù)方丹參注射液2g/（kg·d），壓迫組與減壓組給予等體積生理鹽水，正常對照組動物不進(jìn)行手術(shù)操作。觀察兔后肢并進(jìn)行運(yùn)動功能評分、頸髓組織學(xué)檢查、細(xì)胞凋亡及免疫組化檢查。結(jié)果減壓第1、28天時(shí)復(fù)方丹參+減壓組兔后肢運(yùn)動功能評分分別為（5.33±0.58）分及（6.00±0.00）分，均顯著大于減壓組（3.67±0.58）分及（5.00±0.00）分（P＜0.05）。組織學(xué)檢查顯示，復(fù)方丹參+減壓組兔頸髓神經(jīng)元水腫及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生較減壓組輕。兔頸髓組織免疫組化檢測顯示在第28天時(shí)，復(fù)方丹參+減壓組血管數(shù)（12.33±2.12），顯著多于壓迫組的（5.67±2.50）（P＜0.05），及減壓組（9.78± 2.17）（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡檢測顯示減壓術(shù)后第1、28天，復(fù)方丹參+減壓組頸髓組織凋亡指數(shù)分別為（0.89±0.33）及（0.56±0.53），顯著小于壓迫組的（2.22±1.56）及（4.00±2.12）（P＜0.05），減壓組的（1.78±0.67）及（1.67±0.50）（P＜0.05），與正常對照組（0.78±0.44）及（0.56±0.53）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論復(fù)方丹參注射液可改善壓迫性頸髓損傷兔減壓術(shù)后脊髓的微循環(huán)，減輕減壓術(shù)后缺血再灌注損傷，增強(qiáng)減壓術(shù)的療效，促進(jìn)術(shù)后運(yùn)動功能的恢復(fù)。

兔；壓迫性頸髓損傷；減壓術(shù)；缺血再灌注損傷；復(fù)方丹參注射液

壓迫性脊髓損傷（compressive spinal cord injury）在臨床上十分常見，脊髓型頸椎病是壓迫性脊髓損傷最常見的病因之一[1-2]。目前臨床上無論是采取外科手術(shù)脊髓減壓還是營養(yǎng)神經(jīng)的藥物治療效果都不確切。研究發(fā)現(xiàn)，局部缺血和再灌注損傷在神經(jīng)變性的過程中起了非常重要的作用[3]。中醫(yī)認(rèn)為，脊髓損傷為傷及督脈[4]，復(fù)方丹參注射液具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)的作用。本文采用兔頸髓壓迫性損傷模型，在減壓術(shù)前及術(shù)后給予復(fù)方丹參注射液靜脈注射，探討其對頸髓損傷減壓術(shù)后的缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性新西蘭白兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，購自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，許可證號：SCXK（浙）2010-0047。飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)清潔級實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心。

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉（Sigma，批號120505），復(fù)方丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1301213），TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（ROCHE，貨號11684817910），蛋白酶K（Tiangen）。

1.3 主要儀器 柔性顱骨鉆（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，ZH-RX2型），顯微鏡（BH2型，OLYMPUS公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 24只大白兔隨機(jī)分為壓迫組、復(fù)方丹參處理+減壓組、減壓組及正常對照組，每組6只。除正常對照組外，余三組建立壓迫性頸髓損傷模型：采用3%戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈麻醉動物，頸部消毒，于頸5/6前正中入路，椎間作一直徑4mm圓孔，在鉆頭即將到達(dá)硬膜外腔隙時(shí)注意控制鉆入速度與力度，并及時(shí)取出骨屑，直至鉆頭到達(dá)椎管內(nèi)硬膜外腔隙。攻入無菌塑料螺栓，隔硬脊膜壓迫脊髓，螺釘長度由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，使脊髓受壓約35%，閉合切口。壓迫15天后行減壓術(shù)，旋出螺栓并清除突入椎管的椎間盤等組織，嚴(yán)密止血。復(fù)方丹參處理+減壓組于減壓術(shù)前30min靜脈注射復(fù)方丹參注射液1次，術(shù)后連續(xù)靜脈注射給藥7天，劑量為2g/（kg·d）。壓迫組與減壓組給予等體積生理鹽水，正常對照組動物不進(jìn)行手術(shù)操作。

1.5 三組白兔后肢運(yùn)動功能評分 各組在減壓后1天和28天各取3只白兔，在處死前進(jìn)行改良Tarlov評分[5]對動物后肢功能進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：完全癱瘓，針刺時(shí)下肢無反應(yīng)；1分：完全癱瘓，針刺時(shí)下肢有反應(yīng)，但肢體不能活動；2分：肢體可活動，但不能站立或站立不穩(wěn)（＜5s）；3分：可站立，但無法行走；4分：可行走數(shù)步，但不穩(wěn)定；5分：能緩慢行走，但不靈活，存在一定缺陷；6分：正常行走。

1.6 檢測指標(biāo) 各組在減壓后第1、第28天各處死3只動物，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.6.1 組織學(xué)檢查 處死動物后采用組織學(xué)方法對受壓部位頸髓組織進(jìn)行HE染色切片檢查。

1.6.2 細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法） 石蠟包埋組織4μm切片，采用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，具體流程如下：組織切片常規(guī)脫蠟后，滴加20μg/mL蛋白酶K，PBS漂洗3次。加50μL TUNEL反應(yīng)混合液（每片用5μl TdT+45μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻，即1：9的比例）于標(biāo)本上，PBS漂洗3次，玻片干后加50μL converter-POD于標(biāo)本上，PBS漂洗，在組織處加適量DAB底物，顯微鏡下控制顯色；PBS終止顯色；再用蘇木素復(fù)染后封片。顯微鏡觀察照相。同時(shí)做TUNEL法染色對照試驗(yàn)，TUNEL反應(yīng)液中不加TdT酶。凋亡細(xì)胞在原位末端標(biāo)記后呈特異的棕褐色，稱為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)灰質(zhì)和白質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)目。在高倍鏡（×200倍）下隨機(jī)觀察3個(gè)視野。

1.6.3 免疫組化 石蠟包埋組織4μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。采用兔CD31免疫組化試劑盒，按說明書的步驟進(jìn)行操作。3%過氧化氫溶液封閉約10min，PBS液沖洗3次，每次3min，正常羊血清工作液37℃封閉30min，傾去工作液，滴加一抗4℃孵育過夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照），PBS液沖洗3次，每次3min，滴加二抗，37℃孵育15min，PBS液沖洗3次，每次3min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，樹膠封片。陽性細(xì)胞呈棕黃色至褐色。在高倍鏡（×200倍）下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)數(shù)脊髓內(nèi)陽性血管數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 各組兔后肢運(yùn)動功能評分比較 減壓第1天，復(fù)方丹參+減壓組及正常對照組兔后肢運(yùn)動功能評分均顯著大于壓迫組（P＜0.05），復(fù)方丹參+減壓組評分顯著大于減壓組（P＜0.05）；減壓第28天，復(fù)方丹參+減壓組、減壓組及正常對照組兔后肢運(yùn)動功能評分均大于壓迫組（P＜0.05），復(fù)方丹參+減壓組評分顯著大于減壓組（P＜0.05），見表1。

表1 四組兔后肢運(yùn)動功能評分比較（分±s）

表1 四組兔后肢運(yùn)動功能評分比較（分±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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2.2 HE染色結(jié)果 壓迫組：1天時(shí)見脊髓白質(zhì)區(qū)呈疏松網(wǎng)狀，并見脫髓鞘，白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)局部可見神經(jīng)元及神經(jīng)纖維變性、壞死，壞死周邊有組織水腫。28天時(shí)灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，神經(jīng)元細(xì)胞減少，仍見脫髓鞘，神經(jīng)元變性、壞死等病變。復(fù)方丹參+減壓組：1天時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生較減壓組減輕，但仍可見個(gè)別神經(jīng)元變性。28天時(shí)組織未見明顯病變。減壓組：1天時(shí)見個(gè)別神經(jīng)元變性，膠質(zhì)細(xì)胞增生無明顯差異；28天時(shí)無明顯神經(jīng)元變性，膠質(zhì)細(xì)胞增生減弱，但巨噬細(xì)胞數(shù)量增多。正常對照組：脊髓灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞大而多角，核圓居中，核膜明顯，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，核仁明顯，胞漿豐富且尼氏小體清晰可見；白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維排列緊密整齊，軸突髓鞘結(jié)構(gòu)清晰勻稱。（封三圖1）。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法） 第1天時(shí)，復(fù)方丹參+減壓組及正常對照組兔頸髓組織凋亡指數(shù)顯著小于壓迫組（P＜0.05），減壓組凋亡指數(shù)與壓迫組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），復(fù)方丹參+減壓組凋亡指數(shù)顯著小于減壓組（P＜0.05）。第28天時(shí)，復(fù)方丹參+減壓組、正常對照組及減壓組凋亡指數(shù)均顯著小于壓迫組（P均＜0.05），復(fù)方丹參+減壓組凋亡指數(shù)顯著小于減壓組（P＜0.05），與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和封三圖2。

表2 四組兔脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表2 四組兔脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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2.4 免疫組化 CD31免疫陽性主要定位在血管內(nèi)皮，呈棕黃色至褐色。第28天時(shí)，復(fù)方丹參+減壓組、減壓組兔脊髓組織CD31表達(dá)血管數(shù)顯著多于壓迫組（P＜0.05）；復(fù)方丹參+減壓組顯著多于減壓組（P＜0.05），見表3。

表3 四組兔脊髓組織CD31表達(dá)血管數(shù)比較（±s）

表3 四組兔脊髓組織CD31表達(dá)血管數(shù)比較（±s）

注：與壓迫組比較，*P＜0.05；與減壓組比較，△P＜0.05

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3 討論

由機(jī)械壓迫導(dǎo)致的脊髓損傷是脊柱外科常見疾病，手術(shù)常被認(rèn)為是有效的治療手段。由于減壓前受壓脊髓組織已存在缺血缺氧改變，隨著機(jī)械壓迫解除，不可避免地出現(xiàn)脊髓原缺血局部組織血供驟然增加，即脊髓由缺血狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵俟嘧顟B(tài)[6]。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方丹參注射液對脊髓損傷具有治療作用，且與減壓術(shù)有協(xié)同作用。既往采用復(fù)方丹參注射液治療大鼠脊髓損傷動物模型的研究亦表明復(fù)方丹參治療能夠顯著改善動物模型的后肢運(yùn)動功能評分[7-8]。

對各組動物模型頸髓的組織學(xué)檢查顯示，復(fù)方丹參+減壓組第1天頸髓神經(jīng)元水腫及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生較減壓組輕，無膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤，28天時(shí)頸髓組織未見明顯病變，神經(jīng)元形態(tài)正常。提示復(fù)方丹參注射液對損傷頸髓內(nèi)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。劉世清等[9]研究顯示復(fù)方丹參治療后動物脊髓組織出血壞死范圍較局限，組織水腫較輕，神經(jīng)細(xì)胞腫脹較輕，與本研究結(jié)果一致。

丹參主要通過增加毛細(xì)血管開放，擴(kuò)張微動脈，增加微循環(huán)的血流量，降低微循環(huán)阻力，從而增加微循環(huán)血液灌流[10]。范里等[11]觀察了骨骼肌缺血再灌注前后微循環(huán)變化，發(fā)現(xiàn)靜注丹參可顯著改善微循環(huán)，減輕骨骼肌損傷。本研究結(jié)果顯示，在第28天時(shí)，復(fù)方丹參+減壓組的血管數(shù)顯著多于壓迫組，且多于減壓組，提示復(fù)方丹參注射液可改善微循環(huán)，增強(qiáng)減壓術(shù)的效果。

頸髓組織的TUNEL檢測結(jié)果提示，復(fù)方丹參注射液在減壓術(shù)后可減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元受損，減少脊髓細(xì)胞凋亡。采用復(fù)方丹參注射液治療大鼠脊髓損傷動物模型的研究表明，復(fù)方丹參治療能顯著抑制損傷脊髓內(nèi)的細(xì)胞凋亡[8-9]，與本研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，局部缺血和再灌注損傷在神經(jīng)變性的過程中也起了非常重要的作用[4]。在脊髓繼發(fā)性損傷中，神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生了凋亡與壞死。復(fù)方丹參注射液能對抗脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并能顯著抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的過量表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對脊髓損傷的保護(hù)作用[9]。對大鼠脊髓損傷后脊髓細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用復(fù)方丹參注射液后脊髓細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)目顯著性減少，因此認(rèn)為其可能通過抑制脊髓細(xì)胞凋亡這一途徑，減輕或逆轉(zhuǎn)繼發(fā)損傷的病理過程，而發(fā)揮對脊髓損傷的治療作用[7]。

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（收稿：2016-02-20 修回：2016-05-05）

Adjuvant Therapeutic Effect of Compound Radix Salviae Miltiorrhizae on Decompression of Compressive Cervical Spinal Cord Injury in Rabbits

BIAN Zhenyu,WANG Lei,LI Maoqiang,WANG Xuepeng,ZHU Liu-long. Department of Orthopaedics,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the protective effect of compound radix salviae miltiorrhizae injection on ischemic reperfusion injury after decompression of compressive spinal cord injury.MethodsTwenty-four male New Zealand Rabbits were randomly divided into model group,compound radix salviae miltiorrhizae injection+decompression group（combined treatment group）,decompression alone group,and healthy group,with 6 rabbits in each group.Compressive cervical spinal cord injury model was set up in all groups except for healthy group.Combined treatment group was treated with compound radix salviae miltiorrhizae injection of 2 g/（kg·d）before and after decompression,model group and decompression alone group were treated with the equivalent volume of saline,and healthy group received no intervention procedure.Tarlov scores,cell apoptosis,histological and immunohistochemical features of cervical spinal cords after treatment were compared among groups.ResultsTarlov scores of combined treatment group on day 1 and day 28 after decompression were 5.33±0.58 and 6.00±0.00,which were significantly higher than those of decompression group（3.67±0.58 and 5.00±0.00）,with P＜0.05.Histological examination demonstrated that neuron swelling and neuroglia proliferation of cervical spinal cord in combined treatment group were less severe compared with those of decompression group.Immunohistochemical assay of cervical spinal cord using CD31 indicated that the number of blood vessels in combined treatment group were 12.33±2.12,which were significantly more than that of compression group（5.67±2.50）and decompression group（9.78±2.17）on day 28 afterdecompression,with all P＜0.05.Tunnel assay showed that apoptosis index of cervical spinal cord in combined treatment group were 0.89±0.33 and 0.56±0.53,which were significantly lower than those of compression group （2.22±1.56 and 4.00±2.12,P＜0.05）and decompression group（1.78±0.67 and 1.67±0.50,P＜0.05）on day 1 and 28 after decompression,but did not differ from those of healthy group（0.78±0.44 and 0.56±0.53,P＞0.05）.Conclusion Compound radix salviae miltiorrhizae can improve microcirculation of spinal cord after decompression of compressive spinal cord injury,decrease ischemic reperfusion injury after decompression,enhance therapeutic effects of decompression,and promote motor function recovery after operation.

rabbits;compressive cervical spinal cord injury;decompression;ischemic reperfusion injury;compound radix salviae miltiorrhizae

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011ZA078）

杭州市第一人民醫(yī)院骨科（杭州 310006）

朱六龍，Tel：13486100812；E-mail：zhuliulong@sina.com