王苗娟 陳 瑜 殷 瑛

抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及間隙連接通訊功能的影響

王苗娟 陳 瑜 殷 瑛

目的探討抗肝癌合劑（IPAH）對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞凋亡和間隙連接通訊功能的影響。方法制備抗肝癌合劑含藥血清，分為高、中、低劑量組，另設(shè)陰性對(duì)照組和空白血清對(duì)照組。培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP）觀察對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊功能的影響。結(jié)果抗肝癌合劑中劑量組24、48、72h細(xì)胞凋亡率分別為（8.07±1.12）%、（12.04±2.12）%、（17.90±1.74）%；高劑量組24、48、72h細(xì)胞凋亡率分別為（11.54±2.23）%、（18.29±2.39）%、（22.90±2.43）%，與陰性對(duì)照組 [（2.42±1.15）%、（2.98± 0.92）%、（3.35±0.67）%]及空白對(duì)照組[（3.01±1.07）%、（3.88±0.97）%、（4.09±1.23）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）?？垢伟┖蟿┑?、中、高劑量組熒光恢復(fù)率分別為（22.43±2.62）%、（42.73± 4.36）%、（49.40±5.13）%，隨著時(shí)間和劑量增加，熒光恢復(fù)率明顯增加，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。結(jié)論抗肝癌合劑具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用，呈一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。其作用可能與上調(diào)細(xì)胞間隙連接通訊功能相關(guān)。

肝癌；細(xì)胞凋亡；間隙連接；抗肝癌合劑

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carclnoma，HCC）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其預(yù)后差，居所有惡性腫瘤死亡率第3位[1]。我國(guó)是全球肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年患病者占全球的55%，肝癌為我國(guó)第二位惡性腫瘤致死病因。由于該病起病隱匿、進(jìn)展迅速、早期就診率低，60%～70%的患者在確診時(shí)已處于腫瘤晚期，喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，只能進(jìn)行姑息性的對(duì)癥支持治療[2]。浙江省中醫(yī)院腫瘤科國(guó)家級(jí)名中醫(yī)導(dǎo)師周維順教授根據(jù)中醫(yī)對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)，通過(guò)長(zhǎng)期臨床摸索，以清熱解毒、舒肝理氣、活血化瘀為主要治則，自擬抗肝癌合劑（由柴胡、半枝蓮、蛇舌草、貓人參、生米仁、八月札、莪術(shù)等藥物組成），經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)其對(duì)提高肝癌患者生存期、改善患者生存質(zhì)量有較肯定的療效[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抗肝癌合劑含藥血清作用于人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞，探討其對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及間隙連接通訊功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材 料 雌性日本大耳白兔4只，體質(zhì)量（1.5± 2.5）kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2015-0004。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所。

1.2 藥 物 抗肝癌合劑（主要由半枝蓮、白花蛇舌草、貓人參、貓爪草、茯苓、豬苓、靈芝、蒲公英、柴胡、赤芍、白芍、郁金、莪術(shù)等16味中藥組成），由浙江省中醫(yī)院制劑室提供（批號(hào)20140215），濃度為每毫升含生藥5.2g。

1.3 試 劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶，二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司。Hoechst33342/PI試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。6-羧基熒光素乙酰乙酸鹽（6-Carboxy fluocein diacetate，6-CFDA）購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備 雌性日本大耳白兔4只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組和中藥高、中、低劑量組，每組1只。給藥前所有白兔均禁食、禁水12h，按《人和動(dòng)物體表面積折算等效劑量比值表》計(jì)算灌胃劑量。中藥低劑量組灌胃量相當(dāng)于人臨床等效劑量，按每只動(dòng)物14.3g/（kg·d）給藥，中劑量組取低劑量組的5倍量，高劑量組按低劑量組10倍量給藥?？瞻捉M灌胃蒸餾水1h后，心臟取血。其余三組連續(xù)灌胃抗肝癌合劑3天，每天早、晚各1次，最后一天全天量一次性灌胃后1h，心臟取血，分離血清，56℃滅活，微孔過(guò)濾滅菌，置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721）在含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，1～2天更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞單層鋪滿瓶底后，加0.25%胰蛋白酶，置培養(yǎng)箱內(nèi)1～2min，待鏡下細(xì)胞固縮時(shí)，用尖吸管吹打細(xì)胞使其懸于液體中，加培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞收集于離心管中，1000r/min離心5min，去除胰酶及舊培養(yǎng)液，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，以1∶3傳代培養(yǎng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 分陰性對(duì)照組（PBS溶劑組）、空白血清對(duì)照組、含藥血清高、中、低劑量組。

2.4 流式細(xì)胞儀（FCM）細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，應(yīng)用前應(yīng)RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×105/mL個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入3mL。在5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24h后，添加血清濃度為20%，陰性對(duì)照組加等量的PBS液。處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，胰酶消化并離心（1000r/min，10min）收集細(xì)胞，調(diào)整每管細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，PBS洗2次，加入0.5mL PBS重懸細(xì)胞，加入70%冰乙醇1～2mL迅速混勻，于4℃下固定過(guò)夜。棄除固定的乙醇，加入5mL PBS洗滌，移入離心管，低溫離心（1500r/min，5min），去上清液，重復(fù)PBS離心洗滌2次后，去上清，加1mL PI染料、100μL RNA酶，震蕩混勻，置4℃冰箱避光30min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle軟件分析。

2.5 熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP）觀察對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊功能的影響 （1）細(xì)胞爬片：取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，取36mm直徑的培養(yǎng)皿，內(nèi)置24mm載玻片，每皿內(nèi)添加細(xì)胞數(shù)為2.5×104個(gè)/mL，每皿內(nèi)加培養(yǎng)液至3mL。培養(yǎng)36～48h至細(xì)胞大致鋪滿皿底時(shí)棄掉舊培養(yǎng)液，加入含藥血清0.6mL，另加新培養(yǎng)液2.4mL，即所加含藥血清濃度為20%。再培養(yǎng)24h后，細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)上機(jī)檢測(cè)。陰性對(duì)照組和空白血清組則分別添加20%PBS液及空白血清，細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)上機(jī)檢測(cè)。（2）6-CFDA著色：取出貼壁單層生長(zhǎng)至70%～80%細(xì)胞的蓋玻片，先用Hank’s液清洗2～4次，再加入10μg/mL的6-CFDA 0.5～1.0mL，37℃、5%CO2孵箱中孵育10～15min。取出后用Hank’s液洗掉細(xì)胞外多余的6-CFDA，然后再加入少量Hank’s液，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。（3）GJIC功能測(cè)定：首先選擇兩種細(xì)胞：第1種是周?chē)c其它細(xì)胞緊密連接，需用激光去淬滅的細(xì)胞；第2種是周?chē)c其它細(xì)胞緊密連接，但不需要激光淬滅的細(xì)胞。顯然第1種細(xì)胞存在縫隙連接通訊，是我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的來(lái)源；第兩種細(xì)胞選擇的原因是：熒光物質(zhì)即使在無(wú)激光照射下，也有自身的熒光光漂白作用，選擇此種細(xì)胞作為其它細(xì)胞的背景校正。在確定以上兩種細(xì)胞后，開(kāi)始淬滅前的預(yù)掃描，淬滅完成后，監(jiān)測(cè)兩種細(xì)胞15min，觀察其熒光恢復(fù)情況。全部的FRAP實(shí)驗(yàn)在30～40min內(nèi)完成，包括染料負(fù)載、漂洗、細(xì)胞選擇、淬滅細(xì)胞及掃描。各組實(shí)驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組淬滅10組細(xì)胞。

2.6 熒光漂白恢復(fù)率計(jì)算 應(yīng)用公式F’（t）=F（t）-F （0）/F（∞）-Fa×100%計(jì)算熒光恢復(fù)率，其中F’（t）為某一時(shí)刻目標(biāo)細(xì)胞的熒光恢復(fù)率；F（t）為該時(shí)刻目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)熒光相對(duì)強(qiáng)度；F（0）為漂白結(jié)束時(shí)目標(biāo)細(xì)胞的熒光相對(duì)強(qiáng)度；F（∞）為該時(shí)刻相鄰未漂白細(xì)胞內(nèi)熒光相對(duì)強(qiáng)度；Fa為背景熒光相對(duì)強(qiáng)度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的影響 抗肝癌合劑中劑量組、高劑量組對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721有較明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。低劑量組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡差異不明顯（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的影響（%，±s）

表1 抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的影響（%，±s）

注：與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，▲P＜0.01

組別陰性對(duì)照組空白血清組低劑量組中劑量組高劑量組孔數(shù)6 6 6 6 6 24h凋亡率2.42±1.15 3.01±1.07 3.69±1.46 8.07±1.12▲11.54±2.23▲48h凋亡率2.98±0.92 3.88±0.97 4.22±1.19 12.04±2.12▲18.29±2.39▲72h凋亡率3.35±0.67 4.09±1.23 5.15±0.97 17.90±1.74▲22.90±2.43▲

3.2 抗肝癌合劑對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊功能的影響（熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)） 熒光標(biāo)記染色SMMC-7721細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。FRAP方法測(cè)定各組細(xì)胞的GJIC功能，選擇漂白細(xì)胞（箭頭標(biāo)記）熒光漂白前（A）及漂白后5（B）、10（C）和15（D）min時(shí)的熒光恢復(fù)情況。在培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，經(jīng)瞬間漂白后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?，隨著時(shí)間的推移，熒光逐漸恢復(fù)，至15min時(shí)（D），可見(jiàn)熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)（見(jiàn)封二圖1～4）。相對(duì)而言，培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞，在相同的時(shí)間內(nèi)，漂白細(xì)胞熒光恢復(fù)很不明顯。在漂白后15min，兩組平均熒光恢復(fù)率比較，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），各含藥血清組與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組比較，熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)，平均熒光恢復(fù)率明顯增高（P＜0.01）。抗肝癌合劑三個(gè)劑量組間比較，隨著劑量的增大，熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)，平均熒光恢復(fù)率明顯增高（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721熒光恢復(fù)率的影響（±s）

表2 抗肝癌合劑對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721熒光恢復(fù)率的影響（±s）

注：與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.01；與中劑量組比較，*P＜0.01

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4 討論

細(xì)胞凋亡通常稱(chēng)為程序性死亡（programmed cell death，PCD）。對(duì)多細(xì)胞動(dòng)物機(jī)體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定起著極其重要的作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的新途徑之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，尤以單味藥或其提取物或中藥單體成分研究為多[4]，中藥復(fù)方可能是“多靶點(diǎn)作用”[5]，而細(xì)胞凋亡的發(fā)生又具有多因素、多基因、多層次級(jí)聯(lián)作用特點(diǎn)，故復(fù)方中藥較單一成分藥物更有可能對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控進(jìn)行干預(yù)影響，以及調(diào)節(jié)基因代謝水平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗肝癌合劑中、高劑量組可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系SMM C-7721細(xì)胞凋亡，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明肝癌合劑具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞間隙連接（gap junction）是在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞接觸間普遍存在的的一種質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，是相鄰細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)和信息傳遞的重要膜通道結(jié)構(gòu)。目前連接蛋白家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員，分子量由26～56Kd不等，較為常見(jiàn)的有Cx26、Cx32、Cx43，它們的表達(dá)情況反映細(xì)胞通訊連接（GJIC）的功能狀況。自從發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞間的電偶聯(lián)喪失以來(lái)，許多學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞普遍存在GJIC功能的缺陷及Cx表達(dá)異常的現(xiàn)象，已證實(shí)GJIC在幾乎所有的實(shí)體瘤中表達(dá)下調(diào)或喪失，上調(diào)GJIC可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞表形[6-7]。

近年研究提示，GJIC不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，而且也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者將Cx26基因轉(zhuǎn)染到人的肝細(xì)胞瘤中，Cx26的表達(dá)可以引起細(xì)胞的凋亡[8]。Uphan等[9]研究亦發(fā)現(xiàn)小鼠的肝上皮細(xì)胞系經(jīng)過(guò)神經(jīng)酰胺（包括一個(gè)C6和C8?；鶊F(tuán)）的處理后，表現(xiàn)為GJIC功能下調(diào)及細(xì)胞凋亡的有效抑制，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。由此可見(jiàn)，GJIC和細(xì)胞凋亡的異常在腫瘤中關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗肝癌合劑各劑量組可明顯增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的間隙連接通訊功能，說(shuō)明抗肝癌合劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與其可上調(diào)間隙連接通訊的功能相關(guān)，但具體作用機(jī)制仍不清楚，仍有待深入研究。

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（收稿：2015-11-02 修回：2016-04-10）

Effects of Instant Powder of Anti-hepatocarcinoma on Apoptosis and Gap Junction Intercellular Communica- tion of Human Hepatocarcinoma Cells

>WANG Miaojuan,CHEN Yu,YIN Ying.Department of General Medicine,the First Clinical Medical College,Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the effect of instant powder of anti-hepatocarcinoma（IPAH）on inducedapoptosis and the function of gap junction intercellular communication（GJIC）of human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721.MethodsHigh-,middle-,and low-concentration drug serum was prepared.Negative control and blank control group were set up.Hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 was cultured with different sera in vitro and the apoptosis was detected by flow cytometry,and GJIC was observed with fluorescence recovery experiment （FRAP）.ResultsAt 24,48,and 72 h after culture,the apoptosis rate of SMMC-7721 cells in middle-concentration group were（8.07±1.12）%,（12.04±2.12）%,and（17.90±1.74）%,respectively and that in high-concentration group were（11.54±2.23）%,（18.29±2.39）%,and（22.90±2.43）%,respectively,which were higher than those of negative control group[（2.42±1.15）%,（2.98±0.92）%,（3.35±0.67）%]and blank control group[（3.01±1.07）%,（3.88± 0.97）%,（4.09±1.23）%],with all P＜0.01.Compared with controlled groups,the intensity of fluorescence in low-, middle-,and high-concentration groups were（22.43±2.62）%,（42.73±4.36）%,and（49.40±5.13）%;the intensity increased as the time and concentration increased,with a significant difference among groups（all P＜0.01）.ConclusionIPAH can induce the apoptosis of hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 apoptosis in a dose-and time-depended manner.This may be related to up-regulation of GJIC.

hepatocarcinoma;instant powder of anti-hepatocarcinoma（IPAH）;gap junction intercellular communication;apoptosis

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院全科醫(yī)學(xué)科（杭州 310053）

王苗娟，Tel：15990107711；E-mail：wmj_79@126.com