任莉莉王霖玲王曉稼

苦參堿誘導人乳腺癌Bcap-37細胞發(fā)生自噬與自噬相關(guān)蛋白mTOR相關(guān)性研究

任莉莉1王霖玲2王曉稼1

目的探討苦參堿是否可通過抑制mTOR活性阻斷PI3K/Akt信號通路，誘導人乳腺癌Bcap-37細胞自噬發(fā)生。方法苦參堿（終濃度為0、1、2mg/mL）±氯喹（chloroquine）（自噬抑制劑）處理乳腺癌Bcap-37細胞24h，運用免疫印跡（Western-blot）法檢測PI3K/Akt信號通路自噬相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6、eIF4E表達?？鄥A（終濃度為0、1、2mg/mL）±BafilomycinA1（自噬抑制劑）/Rapamcin（自噬誘導劑）處理乳腺癌Bcap-37細胞24h，Western-blot法檢測eIF4E蛋白的表達。結(jié)果苦參堿劑量依賴性抑制mTOR、p70S6k磷酸化，同時降低eIF4E蛋白表達；當苦參堿聯(lián)合氯喹（CQ）作用于乳腺癌Bcap-37細胞時，則對上述蛋白表達均無明顯抑制作用?？鄥A聯(lián)合BafilomycinA1作用于Bcap-37細胞時，eIF4E蛋白表達同樣無明顯改變；苦參堿聯(lián)合Rapamcin時，eIF4E蛋白表達則呈劑量依賴性降低。結(jié)論苦參堿可通過抑制mTOR活性阻斷PI3K/Akt信號通路，從而誘導人乳腺癌Bcap-37細胞自噬發(fā)生。

苦參堿；Bcap-37細胞；自噬；mTOR；p70S6K；eIF4E

苦參堿（matrine，MAT）是從豆科植物苦參（sophora flavescens ait）的干燥根中提取的一種生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類。近年來有關(guān)其抗腫瘤機制的研究正逐漸成為抗癌中藥研究的一個熱點。我們課題組在前期研究中已證實苦參堿可誘導人乳腺癌Bcap-37細胞發(fā)生自噬[1]。本實驗進一步采用免疫印跡（Western-blot）法檢測PI3K/Akt信號通路上的自噬相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6、eIF4E的表達，明確苦參堿誘導Bcap-37細胞自噬發(fā)生是否與通過抑制mTOR活性阻斷PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材 料 人乳腺癌Bcap-37細胞株（中國科學院上海細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（杭州宏博生物）；苦參堿（悅康藥業(yè)集團悅康甘樂）；氯喹（浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院韓衛(wèi)東博士饋贈）；BafilomycinA1（美國INDOFINE-SB）；Rapamcin（美國MCE）；DMSO（美國Sigma）；PBS緩沖液（PH7.2～7.4）；兔抗人單克隆抗體mTOR（華安生物）；兔抗人單克隆抗體p70s6k（上海安研商貿(mào)有限公司）；兔抗人單克隆抗體eIF4E（華安生物）；凝膠成像系統(tǒng)；電泳儀；電泳轉(zhuǎn)印槽。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)人乳腺癌Bcap-37細胞，至細胞鋪滿瓶底約80%～90%，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，加入DMEM培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，以1：2～1：3傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 Western-blot法檢測mTOR/p-mTOR/p7Os6k/pp7Os6k蛋白表達 將Bcap-37細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入濃度為0、1、2mg/mL苦參堿，作用24h后收集細胞，PBS洗滌3次。按照蛋白提取試劑盒說明進行操作，得到蛋白提取物，用BCA法測定蛋白濃度。選擇15%的SDS-PAGE分離膠、4%的濃縮膠，恒壓80V/120V，待溴酚藍至分離膠底部時，停止電泳。將活化的PVDF膜和膠置入轉(zhuǎn)膜裝置，恒流250mA轉(zhuǎn)膜1.5～2h。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h。一抗4℃度過夜，TBST室溫下脫色搖床上洗3次，再用TBS洗1次。二抗室溫孵育1h，再用TBST洗脫。加ECL避光，化學發(fā)光熒光影像分析儀顯影，保存圖像進行分析。

1.4 Western-blot法檢測mTOR/p7Os6k/p-p7Os6k蛋白表達 將Bcap-37細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入濃度為0、1、2mg/mL苦參堿，同時加入自噬抑制劑CQ（10μmol），作用24h后收集細胞，PBS洗滌3次。按上述方法提取蛋白并檢測。保存圖像進行分析。

1.5 Western-blot法檢測 eIF4E蛋白表達 將Bcap-37細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入濃度為0、1、2mg/mL苦參堿，分別加入自噬抑制劑CQ、BafilomycinA1及自噬誘導劑Rapamcin，作用24h后收集細胞，PBS洗滌3次。余實驗方法同上。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，對結(jié)果進行Spearman相關(guān)分析，檢驗水準a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MAT劑量依賴性抑制mTOR磷酸化 Western-blot結(jié)果顯示，苦參堿作用于人乳腺癌Bcap-37細胞24h后，mTOR蛋白印跡條帶灰度未出現(xiàn)明顯改變，提示該蛋白表達并未隨著苦參堿濃度的增加而變化。當苦參堿聯(lián)合自噬抑制劑CQ同時作用于Bcap-37細胞24h后，mTOR的蛋白表達同樣未出現(xiàn)明顯變化，見圖1。

圖1 苦參堿±CQ作用于人乳腺癌Bcap-37細胞24h后mTOR蛋白表達

2.2 Western-blot結(jié)果 在濃度為0、1、2mg/mL的苦參堿作用24h后，p-mTOR蛋白印跡條帶灰度逐漸下調(diào)，提示該蛋白表達隨著苦參堿濃度的增加而降低，呈劑量依賴性。但是當苦參堿聯(lián)合自噬抑制劑CQ同時作用于該細胞24h后，其蛋白表達變化卻并不明顯（見圖2）。

圖2 苦參堿±CQ作用于人乳腺癌Bcap-37細胞24h后pmTOR蛋白表達

2.3 MAT劑量依賴性抑制p-70s6k磷酸化 苦參堿（0、1、2mg/mL）作用人乳腺癌Bcap-37細胞24h后，Western-blot法檢測p70S6k蛋白印跡條帶灰度略有下調(diào)，提示該蛋白表達降低但不明顯。而pp70S6k蛋白印跡條帶灰度明顯下調(diào)，提示該蛋白表達則隨著苦參堿濃度的增高而顯著下降，呈劑量依賴性（見圖3）。當苦參堿聯(lián)合自噬抑制劑CQ后，p70S6k/p-p7S6k蛋白表達均未出現(xiàn)明顯變化，見圖4。

圖3 苦參堿作用人乳腺癌Bcap-37細胞24h后下調(diào)pp70S6K蛋白表達

圖4 苦參堿聯(lián)合CQ作用于人乳腺癌Bcap-37細胞24h后下調(diào)p-p70S6K蛋白表達

2.4 MAT作用人乳腺癌Bcap-37細胞24h后eIF4E蛋白表達的變化 苦參堿（0、1、2mg/mL）作用人乳腺癌Bcap-37細胞24h后，Western-blot法檢測eIF4E蛋白印跡條帶灰度逐漸下調(diào)，提示該蛋白表達隨著苦參堿濃度的增高而下降，呈劑量依賴性。當在此基礎(chǔ)上聯(lián)合自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）或巴弗洛霉素A1（bafilomycinA1，bafA1）后，EIF4E的蛋白表達未出現(xiàn)明顯變化。當苦參堿聯(lián)合自噬誘導劑雷帕霉素（Rapamcin，RAPA）作用于Bcap-37細胞24h后，Western-blot法檢測eIF4E蛋白印跡條帶灰度明顯下調(diào)，提示該蛋白表達隨著苦參堿濃度的增高而逐漸下降，呈劑量依賴性（見圖5）。

圖5 苦參堿聯(lián)合CQ/bafA1/RAPA作用于人乳腺癌Bcap-37細胞24h后eIF4E蛋白表達改變

3 討論

據(jù)文獻[2]報道，哺乳動物細胞在應(yīng)激情況下的自噬調(diào)節(jié)有很多不同的信號通路參與。其中，PI3K/ Akt/mTOR/p70S6K信號通路被認為是負性調(diào)控自噬啟動的經(jīng)典通路[3]。mTOR（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）是哺乳動物PI3k/Akt信號傳導通路的下游效應(yīng)物，其分子量為289kDa，是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK）蛋白質(zhì)家族的成員。其下游的核糖體蛋白激酶S6K活性受mTOR的調(diào)節(jié)，被mTOR磷酸化激活后抑制自噬現(xiàn)象的發(fā)生[4]。eIF4E也是mTOR的下游信號，是蛋白質(zhì)生物合成、翻譯起始的重要調(diào)控點。刺激因素使mTOR磷酸化激活，并通過激活eIF4E而促進mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成。mTOR和eIF4E是組成此信號傳導途徑的關(guān)鍵控制點和限速點[5]。mTOR主要通過磷酸化40S核糖體S6蛋白激酶（p70 ribosomal protein S6 kinases，p70S6K）來調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)翻譯[6]。同時，也能夠通過調(diào)節(jié)Atgl/ULK等細胞自噬復合物之間的關(guān)系，發(fā)揮對細胞自噬的負性調(diào)控作用，抑制自噬活性[7-10]。mTOR存在兩種不同的復合物形式，即mTORC1（mTOR complex 1）和mT0RC 2，其中mTORC1對雷帕霉素（rapamcin）敏感[11-12]。核糖體蛋白質(zhì)p70S6K、eIF4E位于mTOR信號途徑下游，其活性受mTOR調(diào)節(jié)[13]。因而檢測p70S6K、EIF4E是否活化可以評估m(xù)TOR受抑制程度。本研究主要探討苦參堿誘導的人乳腺癌Bcap-37細胞自噬效應(yīng)的調(diào)節(jié)通路是mTOR依賴性的，抑或是mTOR非依賴性的。

本研究結(jié)果顯示，苦參堿能夠劑量依賴性地抑制mTOR、p70S6k磷酸化，同時抑制eIF4E蛋白的活化。p-mTOR表達降低的同時，p-p70S6k、eIF4E表達也相應(yīng)降低，這正符合mTOR是p70S6k、eIF4E的上游激活信號的理論。由此我們得出結(jié)論：苦參堿通過抑制mTOR蛋白磷酸化，進而抑制其下游p70S6k蛋白的磷酸化和eIF4E蛋白活化，最終解除PI3K/Akt/ mTOR信號通路對自噬現(xiàn)象發(fā)生過程的負性調(diào)節(jié)作用。這與許多自噬相關(guān)文獻報道結(jié)論一致[3，14-16]。

當苦參堿誘導的自噬被氯喹（CQ）抑制時，因其對mTOR磷酸化抑制作用大大減弱，故其下游的p70S6k、eIF4E蛋白表達均未受到明顯抑制。BafilomycinA1是液泡性ATP酶（vacuolar-type ATPase）抑制劑，能阻止自噬體和溶酶體的融合，從而抑制自噬體的降解[17]。同理，苦參堿聯(lián)合BafilomycinA1作用于Bcap-37細胞，eIF4E蛋白表達亦無明顯改變。而當苦參堿聯(lián)合自噬誘導劑Rapamcin時，因其對mTOR磷酸化抑制作用增強，進而其下游的eIF4E蛋白表達受到明顯抑制，呈劑量依賴性降低。

綜上所述，體外實驗苦參堿通過抑制mTOR活性阻斷PI3K/Akt信號通路，從而誘導人乳腺癌Bcap-37細胞自噬發(fā)生。

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（收稿：2016-03-13 修回：2016-05-11）

Relationship Between Matrine Induced Autophagy and mTOR in Human Breast Cancer Bcap-37 Cells

RENLili1,WANG Linling2,WANG Xiaojia1.1 Department of Integrated Chinese and Western Medicine,Zhejiang Provincial Tumor Hospital,Hangzhou(310022),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate whether the matrine induce autophagy in human breast cancer Bcap-37 cells by down-regulating PI3K/Akt signal pathway via inhibition of mTOR or not.MethodsHuman breast cancer Bcap-37 cells were cultured in vitro and treated by different final concentrations（0,1,2 mg/mL）of matrine± chloroquine（autophagy inhibitor）,then cultured for 24 h.Western-blot assay was used to detect the protein expression level of mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6,eIF4E,which were related to PI3K/Akt signaling pathway.The same cells were cultured in vitro and treated by matrine（0,1,2 mg/mL）±bafilomycinA1（autophagy inhibitor）/ rapamcin（autophagy revulsant）for 24 h.Western-blot assay was used to detect the level of eIF4E.ResultsThe expression of p-mTOR,p-p70S6k and eIF4E proteins down-regulated after Bcap-37 cells were treated with matrine at 0,1,2 mg/mL for 24 h in a does-dependent manner,but had no obvious changes after Bcap-37 cells were treated with matrine+chloroquine for the same while.The expression of eIF4E protein also had no obvious change after Bcap-37 cells were treated with matrine+bafilomycinA1 for 24 h,however the expression of eIF4E protein down-regulated after the cells were treated with matrine+rapamcin in a does dependent manner.ConclusionThe molecular mechanism of autophagy induced by the effect of matrine in human breast cancer Bcap-37 cells may be via down-regulating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

matrine;Bcap-37 cells;autophagy;mTOR;p70S6K;eIF4E

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2013KYB04）

1浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科（任莉莉），腫瘤內(nèi)科（王曉稼）（杭州310022）；2浙江中醫(yī)藥大學（杭州 310053）

王曉稼，Tel：13906500190；E-mail：wxj88851@yahoo.com.cn