黃寶菊，王 忠，林梅燕

[安發(fā)(福建)生物科技有限公司 352199]

中華獼猴桃莖段組培快繁系列技術(shù)研究

黃寶菊，王 忠，林梅燕

[安發(fā)(福建)生物科技有限公司 352199]

以中華彌猴桃?guī)б秆壳o段為外植體，研究不同處理方法對外植體滅菌效果的影響，不同激素組合培養(yǎng)基對外植體初代培養(yǎng)和組培苗生根的影響。試驗結(jié)果表明，最佳滅菌處理：先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞進行表面滅菌8 min，外植體成活率88%；最佳初代培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，出芽率92%；最佳生根培養(yǎng)基：1/2 MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根率85.6%。

中華彌猴桃；莖段；組織培養(yǎng)；滅菌條件；激素配方；出芽；生根

中華獼猴桃(簡稱：獼猴桃)屬于獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物，是20世紀人工馴化栽培的野生果樹中最有成就的四大果種之一。其果實具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的藥用價值，尤其是含有大量的維生素C，素有“Vc之王”的美稱。獼猴桃雌雄異株，倍性復雜，育種周期長。傳統(tǒng)的育苗方法主要有扦插和嫁接，但成活率和繁殖效率低。同時在生產(chǎn)栽培中，獼猴桃經(jīng)常發(fā)生潰瘍病等嚴重病害，導致枝條萎蔫、枯死等[1]。目前，大量的獼猴桃種苗生產(chǎn)主要來源于組織培養(yǎng)[2]。

要加快其種苗繁殖速度和促進健康栽培，迫切需要建立科學合理的組培快繁生產(chǎn)體系。近年來，有關(guān)獼猴桃組培技術(shù)的報道頗多，前人對獼猴桃組培的研究方向各有不同。本文以安發(fā)(福建)生物科技有限公司自主選育的獼猴桃新品種——回回1號帶腋芽莖段為材料，從外植體的滅菌，初代培養(yǎng)誘導出芽，生根培養(yǎng)誘導生根三方面進行試驗研究，以期為建立和完善其快繁體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為回回1號兩年生雌雄株，于2014年8月下旬至9月下旬的晴天，取長10～15 cm的健壯新梢上的帶腋芽莖段為試驗材料。

1.2 試驗方法與處理設計

1.2.1 不同消毒方法對外植體滅菌效果的試驗 將帶腋芽的莖段，置于自來水下沖洗30 min，再移至超凈工作臺中，將無菌水倒于燒杯中攪拌清洗6～8遍。先用75%酒精滅菌，再用0.1%升汞進行表面滅菌，然后無菌水沖洗6～8遍，最后用無菌濾紙吸干莖段表面水分。滅菌后，將莖段以腋芽為單位進行裁剪，剪成1.0～2.0 cm帶1個腋芽的莖段，腋芽朝上豎直插入初代培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶中接5個莖段，5次重復。初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L。培養(yǎng)室溫度為(25±1)℃，空氣相對濕度60%，每天光照時間14 h，光照強度2400 lx。初代培養(yǎng)7 d統(tǒng)計污染率、21 d統(tǒng)計成活率。

設75%酒精(滅菌時間分為20 s、30 s、40 s)和0.1%升汞(滅菌時間分為6 min、8 min、10 min)9個滅菌組合的處理(表1)，5次重復。

污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

成活率=成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

1.2.2 不同培養(yǎng)基對初代培養(yǎng)的試驗 將已滅菌的1.0～2.0 cm帶1個腋芽的莖段，腋芽朝上豎直插入誘導培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶中接5個莖段。培養(yǎng)室溫度為(25±1)℃，空氣相對濕度80%，每天光照時間14 h，光照強度2400 lx。誘導培養(yǎng)40 d時統(tǒng)計生長狀況(出芽率)。

設不同激素水平組合的9個初代培養(yǎng)基處理：MS+6-BA(1.0、1.5、2.0) mg/L+NAA(0.1、0.2、0.3)mg/L(表2)，5次重復。

出芽率=出芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

1.2.3 不同培養(yǎng)基對組培苗生根的試驗 將經(jīng)過誘導培養(yǎng)的莖段轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基，腋芽朝上豎直插入生根培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶中接5個莖段。培養(yǎng)室溫度為(25±1)℃，空氣相對濕度80%，每天光照時間14 h，光照強度2500 lx。生根培養(yǎng)30 d時統(tǒng)計根生長狀況。

設不同激素水平組合的9個生根培養(yǎng)基處理：1/2MS+ IBA (0.10、0.15、0.20)mg/L + NAA(0.2、0.3、0.4)mg/L(表3)，5次重復。

生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

生根數(shù)=外植體生根總根數(shù)/接種外植體數(shù)

根長=外植體根的總長度/外植體生根總根數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對外植體滅菌效果的影響

由表1看出，酒精或升汞對外植體滅菌的影響是相似的，當滅菌時間不足時(處理1：75%酒精20 s+0.1%升汞6 min)，污染率高達80%；適當延長滅菌時間，污染率顯著降低，當75%酒精滅菌40 s+0.1%升汞滅菌8 min時，污染率降至8%。表1結(jié)果還表明，雖然延長滅菌時間能夠達到好的滅菌效果，但外植體的成活率卻隨著滅菌時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這與過度滅菌對外植體細胞產(chǎn)生的毒害作用有關(guān)。從污染率和成活率兩方面考慮，以處理5的效果最理想，其污染率20%、成活率88%，即以先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞進行表面滅菌8 min為最佳滅菌處理。

表1 不同滅菌處理對獼猴桃莖段成活率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對不定芽誘導培養(yǎng)的影響

由表2看出，適宜的植物生長激素組合對外植體不定芽的誘導具有促進作用，結(jié)合出芽率數(shù)據(jù)分析，當植物激素濃度較低時(處理1：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)，出芽率最低；植物激素濃度適當升高，出芽率顯著提高，以處理5的出芽率最高；但是，當植物激素濃度繼續(xù)升高時，出芽率反而降低，這與高濃度的植物激素抑制了不定芽的誘導有關(guān)。綜上所述，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最佳初代培養(yǎng)基。

表2 不同誘導培養(yǎng)基對獼猴桃莖段出芽率的影響

注：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS。

2.3 不同培養(yǎng)基對組培苗生根的影響

由表3看出，適宜的植物生長激素組合對外植體不定芽生根的誘導具有促進作用，當激素濃度較低時(處理1、處理2)，生根速度慢，根系虛弱；激素濃度適當升高(處理5)，生根速度加快，根系較強壯；當激素濃度繼續(xù)升高時，根系生長趨于弱化，這與高濃度的植物激素抑制了對不定芽生根的誘導作用有關(guān)。綜上所述，1/2MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.30 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基。

表3 不同生根培養(yǎng)基對獼猴桃組培苗生根的影響

注：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS。

3 結(jié)論與討論

相對于不同滅菌試劑或滅菌試劑組合的效果，滅菌試劑處理時間對外植體的成活率影響很大，直接表現(xiàn)為滅菌試劑處理時間短，滅菌效果差； 而滅菌試劑處理時間過長則可能對外植體的細胞和組織造成損害[3-4]。本試驗結(jié)果表明，對獼猴桃外植體的最適宜滅菌條件為：先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞進行表面滅菌8 min。

適宜的植物激素組合對外植體不定芽的誘導有促進作用，植物生長素(NAA等)和植物細胞分裂素(6-BA等)配合使用，比例協(xié)調(diào)時可促進芽苗主莖生長[5-9]。本試驗在誘導不定芽階段，采用NAA和6-BA配合使用，當6-BA濃度為1.5 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時，出芽率高達92%。

在組培過程中，不定芽的根部生長情況直接影響組培苗的產(chǎn)量，而誘導培養(yǎng)基和植物類激素又在其中起到關(guān)鍵性的促進作用。王大平等[10]認為1/2 MS培養(yǎng)基上最適合用于獼猴桃組織培養(yǎng)的外植體誘導生根，生根率、平均生根數(shù)分別是MS培養(yǎng)基的5.05倍、6.46倍。此外，對于不同的植物生長激素的研究表明，其作用及影響各不相同，如：IBA對外植體根的誘導效果較好[11]，NAA和6-BA按照一定比例混合使用可起到促進芽苗主莖生長的作用。在誘導根的生長階段，本試驗采用NAA和IBA結(jié)合使用，當IBA濃度為0.15 mg/L和NAA濃度為0.30 mg/L時，生根率最高，根數(shù)最多，促進生根的效果明顯。

通常對規(guī)?；参锝M織培養(yǎng)可分為五個階段：外植體滅菌、初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及出瓶煉苗。本試驗是針對外植體滅菌，初代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)3個階段開展的研究，其結(jié)果可為安發(fā)(福建)生物科技有限公司自有品種‘回回1號’獼猴桃工廠化育苗提供一定的技術(shù)支持。同時，獼猴桃組培苗增殖培養(yǎng)、出瓶煉苗等相關(guān)工作還有待于進一步深入研究。

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(責任編輯：楊小萍)

Tissue culture and rapid propagation technique forActinidiachinensis

HUANG Bao-ju, WANG Zhong, LIN Mei-yan

[Anfa(Fujian)Bio-technologyCo.,Ltd.,FujianProvince352199]

Effects of different treatments on explant sterilization, different hormone formulation on initial culture of explant and rooting of tissue culture seedling, were studied, usingActinidiachinensisstem with axillary bud as explant. The results showed that the best sterilizaiton treatment was 75% alcohol for 30 s firstly, and then 0.1% Mercury(II) chloride for 8 min, and the survival rate of explant reached 88%. The optimum initial culture medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L, the budding rate of which was 92%. The optimum rooting culture medium was 1/2 MS+IBA 0.15 mg/L+NAA 0.3 mg/L, with 85.6% of the rooting rate.

Actinidiachinensis; stem; tissue culture; sterilization conditions; hormone formulation; budding; rooting

2016-08-07

黃寶菊，女，1988年生，研究實習員。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.10.001