卞明心　沈若武　劉曉彤　李春雪　李玲　楊永華

[摘要] 目的 探討蜂膠對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響，并初步探討創(chuàng)傷愈合機(jī)制。 方法 60只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（創(chuàng)傷模型+蜂膠組）20只、對(duì)照組（創(chuàng)傷模型+碘伏組）20只、空白組（創(chuàng)傷模型+生理鹽水組）20只，每組再隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（3、5、7、10、14 d），每組每時(shí)間點(diǎn)各4只，采用手術(shù)法復(fù)制大鼠背部皮膚全層1 cm×1 cm的創(chuàng)傷模型，每日換藥。分別于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，切取創(chuàng)面皮膚組織，計(jì)算創(chuàng)傷愈合率，通過(guò)HE染色觀察創(chuàng)面組織學(xué)的變化，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）的動(dòng)態(tài)改變。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組能明顯提高大鼠創(chuàng)傷愈合速度和愈合率（P<0.05或P<0.01）。與空白組比較，HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管、膠原纖維增生明顯，表皮再生完全。免疫組織化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組在3 d時(shí)VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組在5 d時(shí)PDGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 蜂膠在創(chuàng)傷修復(fù)愈合過(guò)程中起明顯促進(jìn)作用，可能與其促進(jìn)血管生成、促進(jìn)肉芽組織以及瘢痕組織增生等作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 蜂膠；碘伏；創(chuàng)傷愈合；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血小板源性生長(zhǎng)因子；中草藥

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）01（c）-0011-04

[Abstract] Objective To discuss the influence of propolis on wound healing and study preliminarily on the mechanism of wound healing. Methods 60 healthy and male Wistar rats were randomly divided into experimental group （wound model+propolis，n=20），control group （wound model+povidone iodine，n=20） and blank group （wound model+physiological saline，n=20）.Each group was then randomly divided into 5 time points：3 d，5 d，7 d，10 d and 14 d with there were 4 rats in each time point.The wound model was established by full-thickness skin injury in rats′ back in size of 1 cm×1 cm，changed dressings every day.The rats were executed in every time point and the injuried skin tissues were cut to calculate the wound healing rate，and the change of wound histology was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining and the dyanmic change of vascular endothelial growth factor（VEGF） and platelet-derived growth factor（PDGF） was detected by immunohistochemical staining method respectively. Results Compared with control group，the experimental group could obviously improve the healing speed and healing rate of wound in rats （P<0.05 or P<0.01）.Compared with blank group，HE staining revealed that remarkable capillary and collagen fiber hyperplasia，and complete epidermal regeneration was observed in experimental group.Immunohistochemical staining revealed that the expression level of VEGF in experimental group was significantly higher than that of control group in 3 d （P<0.05）.The expression level of PDGF was greatly higher than that of control group in 5 d （P<0.05）. Conclusion The propolis plays a significant promotion role in healing and repair of wound，it may be related to promoting angiogenesis，the role of promoting proliferation of granulation tissue and scar tissue.promote the rebuilding of capillaries，acceletate the regeneration of the epidermis and facilitate the formation of scar.

[Key words] Propolis；Povidone-iodine；Wound healing；Vascular endothelial growth factor；Platelet-derived growth factor；Chinese herbal medicine

蜂膠的藥用價(jià)值極高，其化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)化合物、烯、萜類(lèi)化合物及大量微量元素等300多種成分，已被證實(shí)具有降血糖、抗菌、免疫增強(qiáng)、抗炎，抗氧化等多種藥理作用[1-4]，其中抗菌與抗炎作用為創(chuàng)傷愈合提供了藥理基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有部分關(guān)于蜂膠促愈合的研究，而在臨床治療過(guò)程中，碘伏仍是外科創(chuàng)傷的首選消毒、促愈合藥物。本文將蜂膠作為促愈合劑用于創(chuàng)傷模型，通過(guò)HE染色觀察皮膚組織愈合過(guò)程，免疫組織化學(xué)染色動(dòng)態(tài)觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表達(dá)水平[5]，與碘伏進(jìn)行對(duì)比，觀察蜂膠對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響并初步探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康的Wistar大鼠60只，雄性，15周，體質(zhì)量（280±10）g，購(gòu)自青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20100010。單籠單只飼養(yǎng)于28℃清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組20只。

1.2 創(chuàng)傷模型的建立與干預(yù)方法

采用手術(shù)法切除大鼠背部皮膚進(jìn)行造模[6]。造模當(dāng)天以10%的水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，用剃毛器及脫毛劑于大鼠背部胸段兩側(cè)脫毛，暴露皮膚面積約24 cm2。用手術(shù)刀于胸段兩側(cè)作1 cm×1 cm切口，切除全層皮膚至深筋膜，形成兩個(gè)正方形創(chuàng)面。用無(wú)菌棉球擦拭止血，實(shí)驗(yàn)組涂抹蜂膠（成都寶芝堂生物科技有限公司，G20100714），對(duì)照組涂抹碘伏，空白組涂抹生理鹽水，拍照記錄。用無(wú)菌紗布包扎，繃帶固定。大鼠每日自由進(jìn)食、飲水。每日換藥，換藥前記錄創(chuàng)口面積。

1.3 組織取材及處理

分別于手術(shù)后3、5、7、10、14 d灌流固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每組4只，固定前記錄創(chuàng)口面積，不換藥。切取以創(chuàng)面為中心的2 cm×2 cm組織塊，每只取2塊，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片，每塊組織切3張切片，每組24張，隨機(jī)分為4個(gè)亞組，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色，VEGF、PDGF檢測(cè)采用SABC免疫組織化學(xué)染色，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，光鏡下觀察組織變化。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

每個(gè)亞組選取6張切片，400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Simple-PCI圖像分析系統(tǒng)對(duì)組織照片進(jìn)行定量分析。VEGF的表達(dá)以陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比表示（陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%）。陽(yáng)性細(xì)胞主要為胞質(zhì)著色，表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：染色面積<10%（-），染色面積≥10%（+）。PDGF的表達(dá)以平均光密度值表示，陽(yáng)性細(xì)胞主要為胞質(zhì)著色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，正態(tài)分布檢驗(yàn)采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后采用單因素方差分析對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較

3 d時(shí)，各組間愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.56，P<0.01），通過(guò)SNK檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組愈合率明顯高于對(duì)照組（q=3.57，P<0.01），同時(shí)明顯高于空白組（q=4.28，P<0.01）；5 d時(shí)，各組間愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.22，P<0.05），實(shí)驗(yàn)組愈合率明顯高于空白組（q=2.75，P<0.05），對(duì)照組愈合率明顯高于空白組（q=2.17，P<0.05）；7 d時(shí)，各組間愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.58，P<0.05），實(shí)驗(yàn)組愈合率明顯高于空白組（q=2.77，P<0.05），對(duì)照組愈合率明顯高于空白組（q=2.44，P<0.05）；10 d時(shí)，各組間愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.36，P>0.05）；14 d時(shí)，各組間愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=127.06，P<0.01），實(shí)驗(yàn)組愈合率明顯高于對(duì)照組（q=5.66，P<0.05），同時(shí)明顯高于空白組（q=15.74，P<0.01），對(duì)照組明顯高于空白組（q=10.07，P<0.01）（表1）。

2.2 HE染色結(jié)果

3 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組仍有單核粒細(xì)胞滲出，伴有少量毛細(xì)血管增生，空白組中性粒細(xì)胞滲出明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高。5 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)較多毛細(xì)血管增生，肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，成纖維細(xì)胞增生，傷口進(jìn)入典型增殖期。對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，肉芽組織生長(zhǎng)情況較弱。7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肉芽組織進(jìn)一步生長(zhǎng)，生發(fā)層開(kāi)始增厚，毛細(xì)血管數(shù)量增多，表皮細(xì)胞開(kāi)始從傷口邊緣向中心移行。對(duì)照組未見(jiàn)表皮細(xì)胞的增殖移行。10 d時(shí)，各組均有肉芽組織填埋傷口，纖維組織增生明顯，瘢痕組織開(kāi)始形成，實(shí)驗(yàn)組新生上皮較厚，移行較快。14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；對(duì)照組與空白組上皮較薄，再生不完全（圖1）。

2.3 3組不同時(shí)間VEGF、PDGF表達(dá)水平的比較

VEGF表達(dá)水平在3 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.20，P<0.05），通過(guò)SNK檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=2.66，P<0.05），同時(shí)明顯高于空白組（q=2.32，P<0.05）；5 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.94，P<0.05），實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=2.81，P<0.05）；7 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.22，P<0.05），實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=2.56，P<0.05），空白組VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=2.47，P<0.05）。PDGF表達(dá)水平在5 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.48，P<0.05），通過(guò)SNK檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組PDGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=3.56，P<0.01）；7 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.685，P<0.01），實(shí)驗(yàn)組PDGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=3.84，P<0.01），空白組PDGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（q=2.59，P<0.05）；10 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.47，P<0.05），對(duì)照組PDGF表達(dá)水平明顯高于實(shí)驗(yàn)組（q=3.57，P<0.01）；14 d時(shí)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.61，P<0.01），實(shí)驗(yàn)組PDGF表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（q=3.78，P<0.01），同時(shí)明顯低于空白組（q=3.37，P<0.01）（表2、圖2）。

3 討論

蜂膠廣泛的藥理作用使其即可內(nèi)服又可外用，并且具有外用創(chuàng)傷藥的普遍作用效果[7-8]，在2010年版的《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）中就記載了蜂膠“外用解毒消腫，收斂生肌”的功效[9]，促愈合效果顯著。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)傷愈合率均明顯高于空白組（P<0.05），說(shuō)明蜂膠具有明顯促進(jìn)傷口愈合的效果。3 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)傷愈合率明顯高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明蜂膠與碘伏相比，能夠有效促進(jìn)創(chuàng)面的收縮，減少創(chuàng)面面積及表皮爬行范圍，加快愈合。從常規(guī)HE染色結(jié)果得出，實(shí)驗(yàn)組肉芽組織從3 d開(kāi)始出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象，肉芽毛細(xì)血管豐富，生長(zhǎng)旺盛，加快愈合，說(shuō)明蜂膠能加快肉芽組織的形成，在一定程度上促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，使創(chuàng)傷修復(fù)加快進(jìn)入增殖期。

VEGF是特異性最高同時(shí)也是作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子，其可促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，增加血管的通透性，促進(jìn)血管的生成，同時(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性[10-12]。琚晨焰等[13]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯較高，與胃癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，陳芳等[14]發(fā)現(xiàn)，VEGF高水平表達(dá)極大地促進(jìn)了腫瘤血管的生長(zhǎng)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷具有拮抗作用。創(chuàng)傷組織中豐富的新生血管為創(chuàng)面提供了充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保證了肉芽組織迅速增生。本研究免疫組織化學(xué)染色中，VEGF在創(chuàng)傷愈合早期起顯著作用，實(shí)驗(yàn)組3 d時(shí)表達(dá)水平與對(duì)照組、空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組能有效刺激VEGF的生成，促進(jìn)傷口組織毛細(xì)血管的增生、增殖，為創(chuàng)面愈合提供必需的物質(zhì)條件。

PDGF能使成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞直接參與肉芽組織的形成，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)物增多，使膠原合成增多，還可以促使VEGF轉(zhuǎn)錄和分泌從而促進(jìn)血管生成[15-18]。Hom等[19]通過(guò)病例研究發(fā)現(xiàn)，使用PDGF治療可以促使患者傷口內(nèi)肉芽組織得到充分填埋； LaRochelle等[20]發(fā)現(xiàn)，PDGF與卵巢、腎、肺等部位的癌癥患者均有一定的相關(guān)性，可促進(jìn)腫瘤的侵襲。創(chuàng)面組織中PDGF的含量高低可以很好地反映創(chuàng)面增殖期傷口的愈合情況。本研究免疫組織化學(xué)染色中，PDGF在5 d時(shí)呈高表達(dá)，5、7 d時(shí)表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組能夠更早形成大量的肉芽組織，激發(fā)肉芽組織的增殖生長(zhǎng)，加快創(chuàng)面充填，加速愈合。

綜上所述，蜂膠在創(chuàng)傷修復(fù)方面療效可觀，與單純擦拭碘伏相比具有更好的促愈合效果，值得在臨床創(chuàng)傷修復(fù)治療中推廣應(yīng)用。

致謝：感謝夏玉軍教授對(duì)文章討論部分提出的寶貴意見(jiàn)，感謝李陽(yáng)、嚴(yán)金光同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的大力協(xié)助。

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（收稿日期：2015-09-23 本文編輯：許俊琴）