張欣，亞森·克力木，姚粟，劉洋，翟磊，程池，*

(1．中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015; 2．新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆烏魯木齊 830000)

一株分離自“生命營(yíng)養(yǎng)液”細(xì)菌菌株的分類鑒定

張欣1，亞森·克力木2，姚粟1，劉洋1，翟磊1，程池1，*

(1．中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015; 2．新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆烏魯木齊 830000)

從新疆地區(qū)特色飲料“生命營(yíng)養(yǎng)液”中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株CICC 10820。旨在明確菌株CICC 10820的分類地位，為研究飲料“生命營(yíng)養(yǎng)液”的營(yíng)養(yǎng)功效及該菌的生物學(xué)功能和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。依次采用16S rRNA和磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)基因序列分析的分子分類鑒定工具對(duì)分離菌株進(jìn)行分類鑒定，鑒定結(jié)果，菌株CICC 10820為第三梭菌(Clostridium tertium)。

生命營(yíng)養(yǎng)液;第三梭菌;CICC 10820;鑒定

“生命營(yíng)養(yǎng)液”是我國(guó)新疆地區(qū)的一種特色自然發(fā)酵功能性飲料，以新疆特產(chǎn)干果(巴旦木、核桃、杏仁等)、豆類(黃豆、綠豆、黑豆等)、谷類(小麥、大米、黑米等)及多種干鮮果類和蔬菜類等多種天然食材為原料，按照特定的配比，經(jīng)水蒸煮、過濾，濾液再在特定的溫度下進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵、有氧發(fā)酵等復(fù)雜自然發(fā)酵過程，整個(gè)發(fā)酵過程歷時(shí)4個(gè)月［1］?！吧鼱I(yíng)養(yǎng)液”富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分和功能因子，提高人體免疫力，對(duì)心血管疾病、糖尿病、多種炎癥的控制和輔助治療具有積極的效果［2］。趙婷等［3］發(fā)現(xiàn)其含有天然的抑菌活性成分，對(duì)大腸埃希氏菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌等多種致病菌具有抑菌活性。陳建國(guó)等［4］發(fā)現(xiàn)“生命營(yíng)養(yǎng)液”具有體外抗HIV-1活性，其作用機(jī)制可能抑制病毒的整合。

菌種是微生物發(fā)酵食品的重要組成部分。發(fā)酵菌種代謝產(chǎn)生各種更易人體吸收的營(yíng)養(yǎng)元素和功能因子，傳統(tǒng)發(fā)酵菌種又往往是益生菌，通過在人體中定植，發(fā)揮有益作用。目前還未見關(guān)于對(duì)這種特色發(fā)酵制品微生物方面的研究報(bào)道。本課題組對(duì)“生命營(yíng)養(yǎng)液”的微生物組成和活性成分進(jìn)行了解析，獲得了有價(jià)值的微生物資源和功效組分?jǐn)?shù)據(jù)。本研究選取自“生命營(yíng)養(yǎng)液”中分離到的優(yōu)勢(shì)菌株CICC 10820為研究對(duì)象，利用16S rRNA和tpi基因基因條形碼序列(bar-coding)對(duì)其進(jìn)行鑒定，以明確其分類學(xué)地位，為下一步深入研究該發(fā)酵菌種的生物功能與“生命營(yíng)養(yǎng)液”功效性成分間的關(guān)系，以及發(fā)酵菌劑的研制奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，明確的分類名稱也是未來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)食品微生物菌種的管理的基本要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株分離自“生命營(yíng)養(yǎng)液”樣品(樣品由新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司提供)，并保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號(hào)為CICC 10820。NA培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、DL 2000 Marker均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

5415 R型高速冷凍離心機(jī)，日本LUBOTA公司; Professional TRIO 48型基因擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI公司; LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;DK-12型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

采用稀釋平板涂布法進(jìn)行菌株的分離。在無(wú)菌條件下，吸取“生命營(yíng)養(yǎng)液”樣液25 mL于裝有玻璃珠的225 mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻。用移液器取混合液1 mL加入到9 mL具塞玻璃試管中，充分振蕩混勻，依次進(jìn)行梯度稀釋，制備成1× 10-3～10 mL/L的系列稀釋液。分別取0．1 mL涂布到NA培養(yǎng)基平板，置于30℃下培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取優(yōu)勢(shì)菌落于NA培養(yǎng)基平板劃線，置于30℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出形態(tài)統(tǒng)一的菌落后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的NA斜面培養(yǎng)后于4℃保藏，保藏編號(hào)CICC 10820。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

將供試菌株接種于NA固體培養(yǎng)基，置于30℃培養(yǎng)48 h后，觀察其菌落形態(tài)特征并利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行菌體形態(tài)特征觀察［5］。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株CICC 10820基因組DNA。采用劉洋等［6］的方法以基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因序列并用ABI 3700基因測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)［7］，采用CLUSTAL W對(duì)CICC 10820及其若干近緣種16S rRNA基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)［8］，并利用N-J法通過MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析［9］。

1.3.4tpi基因序列分析

以菌株CICC 10820基因組DNA為模板，利用tpi基因序列的特異性引物及條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增［10-11］。擴(kuò)增條件為94℃5 min;94℃30 s;55℃30 s;72℃30 s;40個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃保存。產(chǎn)物用ABI 3700基因測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序得到的結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

菌株CICC 10820在NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2 d，見圖1。由圖1a可見，該菌落較小，呈白色，圓形，不透明;由圖1b可見，利用光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體為桿狀，大小為0．6 μm×(1．6～5．0)μm，單個(gè)排列，革蘭氏陽(yáng)性。

圖1 菌株CICC 10820形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig．1Morphological observation of strain CICC 10820

2.2 16S rRNA基因序列分析

菌株CICC 10820的基因組DNA提取結(jié)果見圖2，所提取的DNA片段約為23．1 kb，利用引物27 f和1 492 r擴(kuò)增得到16S rRNA基因全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及分析處理后，將序列信息提交至Gen-Bank，登錄號(hào)為KU324429。以Bacillus subtilisDSM 10T(AJ276351)為外群，構(gòu)建CICC 10820與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。由系統(tǒng)發(fā)育分析確定菌株CICC 10820歸屬為梭菌屬(Clostridiumsp．)。

2.3 tpi基因序列分析結(jié)果

以菌株CICC 10820的基因組DNA為模版，利用特異性引物(tpiA/tpiB)擴(kuò)增菌株tpi基因序列，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及分析處理后，將序列信息提交至Gen-Bank，登錄號(hào)為KU324430。將序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，與第三梭菌(Clostridium tertium)的基因序列的相似性為99%，與梭菌屬中的其他近緣種的相似性均低于95%。圖4為以ClostridiuminnocuumATCC 14501T(AY700148)為外群，構(gòu)建CICC 10820與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。由系統(tǒng)發(fā)育分析確定菌株CICC 10820被鑒定為第三梭菌(Clostridium tertium)。

圖2 CICC 10820基因組DNAFig．2CICC 10820 genomic DNA

圖3 CICC 10820 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig．3Phylogenetic analysis of CICC 10820 16S rRNA gene

圖4 CICC 10820 tpi基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig．4Phylogenetic analysis of CICC 10820 tpi gene

2.4 菌株CICC 10820分類鑒定結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)觀察，16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析及tpi基因序列的比對(duì)分析，分離自“生命營(yíng)養(yǎng)液”樣品中的菌株CICC 10820被鑒定為第三梭菌(Clostridium tertium)。

3 結(jié)論

與表型鑒定的傳統(tǒng)微生物鑒定方法相比，分子生物學(xué)方法更加準(zhǔn)確、快捷，已廣泛用于微生物的分類鑒定。16S rRNA基因已是公認(rèn)的細(xì)菌分類鑒定的基本標(biāo)尺，常用于微生物屬、群水平的鑒定，與其他看家基因、功能基因等結(jié)合使用可將微生物鑒定至更小的分類單元。磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)基因是梭菌鑒定的有力工具，能有效區(qū)分梭菌屬內(nèi)不同菌種［10-11］。本文通過測(cè)定16S rRNA基因和tpi基因序列，與權(quán)威核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)模式菌株進(jìn)行相似性比對(duì)，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析的分子生物學(xué)方法，將菌株CICC 10820準(zhǔn)確鑒定為第三梭菌(Clostridium tertium)。

第三梭菌由Henry等［12］于1917年首次發(fā)現(xiàn)，最初命名為Bacillus tertius。隨著研究的深入和分類學(xué)的發(fā)展，該菌的分類地位發(fā)生了很大變化，由最初的芽孢桿菌屬(Bacillussp．)轉(zhuǎn)移到梭菌屬(Clostridiumsp．)［13］。1980年國(guó)際微生物委員會(huì)正式將其更名為第三梭菌(Clostridium tertium)，隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)，梭菌綱(Clostridia)，梭菌目(Clostridiales)，梭菌科(Clostridiaceae)，梭菌屬(Clostridium)［14］。目前，梭菌屬(Clostridiumsp．)共209個(gè)種。代表種為酪酸梭菌(Clostridium butyricum)，產(chǎn)丁酸，并能以芽胞形式到達(dá)腸道，并發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用，作為益生菌微生態(tài)產(chǎn)品，已商業(yè)化應(yīng)用于保健品、藥品、食品添加劑、飼料添加劑等領(lǐng)域［15-16］。目前，關(guān)于第三梭菌(Clostridium tertium)研究方面的報(bào)道較少。Kataoka等［17］從植物蓮花根部土壤中分離到第三梭菌(Clostridium tertium)，該菌能夠利用纖維二糖、果糖、明膠、糖原、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蜜二糖、棉子糖、核糖、淀粉、蔗糖、木糖、海藻糖等多種碳源和牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2HPO4、(NH4)2CO3等多種有機(jī)、無(wú)機(jī)氮源，并產(chǎn)生醋酸鹽、丁酸鹽等有機(jī)酸［17］。第三梭菌(Clostridium tertium)能分泌大量的胞外酶，尤其是能分解半纖維素的甘露糖酶，在食品、飼料添加劑領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［17-19］?！吧鼱I(yíng)養(yǎng)液”發(fā)酵原料中含有的豆類和干果，其占很大比例。第三梭菌(Clostridiumtertium)分泌的甘露糖酶對(duì)這些豆科植物種子、干果中富含的半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳糖等半纖維素的分解可能產(chǎn)生積極作用。因此，猜測(cè)該菌種可能來(lái)源于這些干果、豆類植物的生長(zhǎng)環(huán)境(如土壤、植物表面)或者屬于植物內(nèi)生菌，內(nèi)生于干果或豆科類植物的種子。第三梭菌(Clostridium tertium)作為兼性厭氧菌，能夠適應(yīng)“生命營(yíng)養(yǎng)液”的無(wú)氧、有氧二次發(fā)酵環(huán)境條件。另外，第三梭菌(Clostridium tertium)也有作為益生作用的報(bào)道。Borody［20-21］利用包括第三梭菌(Clostridium tertium)在內(nèi)的梭菌、雙歧桿菌、乳酸菌等組成益生菌制劑，用于治療腸道菌群異常引起的慢性疾病，如腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)。本文從新疆特色發(fā)酵飲品“生命營(yíng)養(yǎng)液”中分離到優(yōu)勢(shì)菌株，通過分子生物學(xué)方法將其鑒定為第三梭菌(Clostridium tertium)，為下一步深入研究該菌的生物學(xué)功能、菌劑的開發(fā)以及“生命營(yíng)養(yǎng)液”飲品的營(yíng)養(yǎng)保健功效等方面奠定基礎(chǔ)。

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Identification of Bacterial Strain Isolated from Life Nutrition Liquid

ZHANG Xin1，Yasin Kirim2，YAO Su1，LIU Yang1，ZHAI Lei1，CHENG Chi1，*
(1．China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industuies，Beijing 100015，China;2．Xinjiang ALDOS Biological Development Co Ltd，Urumqi 830000，China)

The bacterial strain CICC 10820 isolated from life nutrition liquid was identified via 16S rRNA and tpi gene sequences analysis．According to the result，strain CICC 10820 was identified as Clostridium tertium．This research will provide the foundation for the further study．

life nutrition liquid;Clostridium tertium;CICC 10820;identification

李寧)

TS275．4

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 006

2095-6002(2016)06-0031- 05

2016-01- 04

國(guó)家微生物資源平臺(tái)專項(xiàng)(NIMR2015-4)。

張欣，男，工程師，碩士，主要從事微生物分類學(xué)研究;

*程池，男，教授級(jí)高工，主要從事微生物學(xué)研究。

。

張欣，亞森·克力木，姚粟，等．一株分離自“生命營(yíng)養(yǎng)液”細(xì)菌菌株的分類鑒定［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34 (6):31-35．

ZHANG Xin，Yasin Kirim，YAO Su，et al．Identification of bacterial strain isolated from life nutrition liquid［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):31-35．