陳衛(wèi)明，尹美麗，鐘機，趙卉雙，陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

酶解制備貽貝抗氧化肽與功能性魚糕的研制

陳衛(wèi)明，尹美麗，鐘機，趙卉雙，陳麗嬌*

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

開發(fā)具有抗氧化活性的功能性魚糜制品。采用酶解法并篩選中性蛋白酶為最適蛋白酶制備貽貝抗氧化肽。利用正交設(shè)計優(yōu)化酶解工藝條件，確定酶解溫度45℃、酶解時間1 h、酶添加量1 500 U/g、料液比(g/mL)1∶5為較優(yōu)酶解工藝條件，在此條件下酶解產(chǎn)物多肽得率達(dá)到(73．62± 0．86)mg/g。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的經(jīng)冷凍干燥的貽貝酶解產(chǎn)物到魚糕中，檢測其在魚糕中對豬油的抗氧化作用，經(jīng)方差分析得知其有顯著的抗氧化作用。以此說明魚糕是具有抗氧化性的功能性食品。

貽貝;抗氧化肽;功能性食品

貽貝是一種雙殼類的貝類海洋軟體動物，屬于高蛋白、低脂肪海產(chǎn)品，具有“海中雞蛋”的美譽［1］。貽貝不僅營養(yǎng)豐富，還有重要的醫(yī)藥價值，其蛋白質(zhì)多肽具有良好的抗氧化作用?？寡趸氖巧锘钚噪牡囊环N，通過減少氧自由基、羥自由基達(dá)到抗衰老的功能，安全性高，同時還能防止油脂氧化［2］。

活性多肽在食品中的應(yīng)用主要包括生產(chǎn)功能性食品、保健食品以及用于保障食品質(zhì)量和延長食品貨架期三方面［3］，現(xiàn)有研究利用分離蛋白經(jīng)酶解、離心、濃縮等工藝開發(fā)出功能性多肽保健食品和功能性多肽飲料［4-6］，而抗氧化肽被利用于食品中，并研制具有抗氧化功能食品的研究報道較少。

將貽貝抗氧化肽添加到魚糜制品開發(fā)含有抗氧化肽的功能性魚糕，采用酶解法制備貽貝抗氧化肽，并采用食品模型抗氧化肽活性檢測方法評價魚糕中抗氧化肽的活性，以證明含抗氧化肽的魚糕具有抗氧化功能。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗材料

堿性蛋白酶和中性蛋白酶購于北京Solarbio公司;胰蛋白酶購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶購于上海源葉生物科技有限公司;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)四肽、DPPH均購于Sigma公司;氫氧化鈉、三氯乙酸、硫酸銅、沸點30～60℃石油醚、冰乙酸、三氯甲烷、乙醚、無水乙醇、碘化鉀、硫代硫酸鈉購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。新鮮的貽貝購于福州市永輝超市;魚糜購于福建坤興海洋生物有限公司;新鮮的豬油購于福州大潤發(fā)超市。

1.2 實驗設(shè)備

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LGJ-12S型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;TGL-16C型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;AB204/A型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;食品料理機，德國博朗電器公司。

2 實驗方法

2.1 貽貝的酶解工藝流程

新鮮貽貝清水清洗→去殼取肉→貽貝肉打漿→冷凍備用→解凍→加水勻漿→加入蛋白酶→酶解處理→酶解產(chǎn)物滅酶處理(95℃，15 min)→離心(5 000 r/min，15 min)→得到酶解液。

2.2 酶解貽貝最適酶的篩選

實驗選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶5種酶分別在各自最適pH值和溫度下酶解貽貝肉漿(見表1)。酶解工藝按照2.1的流程操作，用質(zhì)量濃度100 g/L的檸檬酸和碳酸氫鈉水溶液調(diào)pH值，得到酶解上清液。取得的上清液經(jīng)冷凍干燥后，配成15 mg/mL的水溶液，測定其DPPH·清除率，并分析抗氧化活性。

表15 種蛋白酶酶解優(yōu)選條件Tab．1Optimized enzymolysis conditions of five kinds of protease

2.3 最適蛋白酶單因素實驗

通過實驗篩選得到優(yōu)選蛋白酶，再經(jīng)單因素實驗確定酶添加量、酶解時間、酶解溫度和料液比4個因素對蛋白酶酶解貽貝肉漿多肽得率的影響。在酶添加量分別為300，600，900，1 200，1 500 U/g，酶解時間為1，2，3，4，5 h，酶解溫度為40，45，50，55，60℃，料液比(g/mL)為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的條件下進行實驗。

2.4 貽貝酶解液多肽得率的測定方法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取若干個10 mL的容量瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸水溶液依次配制0．0，0．2，0．4，0．6， 0．8，1．0，1．2，1．4，1．6，1．8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按樣液∶雙縮脲試劑為3∶2的比例于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測定吸光度值。以肽的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1。 2.4.2多肽得率的測定方法

圖1 多肽質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1Standard curve of polypeptide contents

稱取質(zhì)量m(g)的貽貝肉漿，經(jīng)2.1酶解工藝流程得到酶解上清液，量取其總體積V(mL)。參照文獻［8］，采用雙縮脲法，并對照標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)，再根據(jù)式(1)計算多肽得率X。

2.5 DPPH·清除率測定方法

按照2.1酶解工藝流程得到酶解上清液，冷凍干燥后，配成15 mg/mL的水溶液，參照文獻［9］的方法。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇配制濃度為0．2 mmol/L的DPPH溶液，樣品溶液加DPPH溶液為實驗組，在517 nm測其吸光值，記為Ai;對照組為95%乙醇加DPPH溶液，吸光值記為Ac;樣液加95%乙醇為空白組，吸光值記為Aj，并按照式(2)計算樣液對DPPH·清除率R。

2.6 含抗氧化肽的貽貝酶解產(chǎn)物粉末制備

依據(jù)中性蛋白酶酶解貽貝優(yōu)選酶解工藝條件，并按照2.1的酶解工藝流程操作得到含抗氧化肽的貽貝酶解液(未離心取得上清液)，然后經(jīng)真空冷凍干燥24 h得到含抗氧化肽的貽貝酶解產(chǎn)物粉末。

2.7 魚糕制作工藝

魚糜未完全解凍前切成小塊→按比例稱量各輔料(食鹽、淀粉、蛋清)和貽貝肉漿→擂潰→成型→冷凍凝膠化→熟制→冷卻→包裝并置于4℃左右保鮮備用。

2.8 檢測魚糕中貽貝抗氧化肽活性實驗方法

按照2.6制備含抗氧化肽的貽貝酶解產(chǎn)物，同時按照2.7的工藝，在魚糜擂潰過程添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，4%和6%的含抗氧化肽的貽貝酶解產(chǎn)物粉末制作貽貝魚糕，并且加工過程中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的豬油。參照嚴(yán)群芳等［10］和賈薇［11］的實驗方法設(shè)計實驗方案，以含貽貝抗氧化肽的魚糕中萃取的油脂為實驗組，不含有抗氧化肽的魚糕中萃取的油脂為對照組，新鮮豬油為空白組進行分析。實驗操作流程:2種魚糕切成相同大小的塊狀→熱油中油炸(4 min)→冷卻→去除魚糕表面的油(石油醚浸提)→包裝→冷鮮保藏(4℃，24 h)→絞碎成泥→萃取豬油(石油醚浸泡24 h)→豬油水浴加熱揮發(fā)石油醚→測定油脂過氧化值和酸價。

2.9 油脂指標(biāo)測定方法

根據(jù)GB/T 5009．37—2003的方法測定豬油的酸價和過氧化值。

2.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)都取3次重復(fù)實驗的平均值，采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析和正交優(yōu)化分析，p＜0．05的差異顯著水平的結(jié)果被采用。

3 結(jié)果與分析

3.1 最適酶的篩選

酶的選擇是一個關(guān)鍵因素，它決定了水解肽鍵的作用位點和肽鏈長度。不同的酶因作用基團的特異性，水解蛋白質(zhì)長肽鏈上不同的部位，生成不同的酶解產(chǎn)物，因此酶的選擇決定了產(chǎn)物的性質(zhì)和功能。

DPPH·清除率隨著5種酶添加量的增加先增加后減少(見圖2)，其中胰蛋白酶的變化很小，DPPH·清除率為80%～81%;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶在酶添加量900 U/g和1 200 U/g都達(dá)到最高值90%左右;中性蛋白酶的變化較大，最大值可以達(dá)到83．84%;堿性蛋白酶作用下的酶解產(chǎn)物DPPH·清除率最低，最高時只達(dá)到40．79%。由此可知，堿性蛋白酶酶解動物蛋白制備抗氧化肽效果較差，這是因為堿性蛋白酶是疏水性蛋白酶，酶解植物蛋白較合適［12］。

圖2 5種蛋白酶對DPPH·清除率的影響Fig．2Effects of five kinds of proteases on DPPH radical scavenging activities

除堿性蛋白酶外，其余4種蛋白酶酶解得到的貽貝酶解產(chǎn)物DPHH·清除率都很高，而其中中性蛋白酶是屬于微生物蛋白，相對于其他酶成本更低。所以選擇中性蛋白酶為酶解貽貝制備抗氧化肽的最適酶。

3.2 中性蛋白酶酶解條件單因素實驗研究

3.2.1 酶解溫度的影響

抗氧化得率的趨勢是隨著溫度的升高先升高后降低，并在50℃取得了最大值(見圖3)。通過多重比較可得到，50℃組的實驗結(jié)果與其他組之間有顯著性差別，而45，55，60℃3組的2個指標(biāo)的數(shù)據(jù)結(jié)果無顯著性差別。這可以表明45～60℃是中性蛋白酶酶解貽貝最適的溫度范圍。所以選擇45，50，55℃3組做進一步優(yōu)化。

圖3 酶解溫度對多肽得率的影響Fig．3Effects of temperature on yield of peptides

3.2.2 酶添加量的影響

酶添加量在300～1 200 U/g多肽得率隨酶添加量增加而增加，而在1 500 U/g反而下降(見圖4)。這可以表明酶添加量的增加可以提高酶解效率，但不是越多越好，當(dāng)酶添加量大于最適濃度時，其作用效果不會明顯提高，甚至?xí)霈F(xiàn)酶自溶現(xiàn)象［7，13］，降低酶的作用效果。所以取900，1 200，1 500 U/g 3組酶添加量做進一步優(yōu)化實驗。

3.2.3 酶解時間的影響

多肽得率在3 h前是隨著時間的延長而增加的，之后隨時間的延長反而減少(見圖5)。這可能是因為時間的延長使蛋白多肽由于溫度作用或體系pH值的改變而疏水性增加，活性下降，最終導(dǎo)致多肽得率降低。綜上所述可知3 h之內(nèi)是最佳酶解時間范圍，選擇1，2，3 h做進一步優(yōu)化實驗。

圖4 酶添加量對多肽得率的影響Fig．4Effects of enzyme additions on yield of peptides

圖5 酶解時間對多肽得率影響Fig．5Effects of enzymatic time on yield of peptides

3.2.4 料液比的影響

多肽得率隨水量增加呈先增加后減少的趨勢(見圖6)。這是因為水在酶解過程中起到反應(yīng)介質(zhì)和運輸載體的作用，使底物和蛋白酶均勻分布，以便兩者充分接觸，增加碰撞機率和酶解效率。但是水量進一步增加會降低酶濃度，進而降低酶的作用效果。多肽得率在料液比(g/mL)1∶3和1∶4時都可取得最大值(方差分析可得2組沒有顯著性差別)。所以選擇料液比(g/mL)1∶3，1∶4，1∶5做進一步優(yōu)化實驗。

3.3 中性蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化

3.3.1 正交設(shè)計優(yōu)化貽貝酶解工藝條件和水平

根據(jù)單因素實驗確定酶添加量、酶解時間、酶解溫度和料液比4個因素的影響水平，因素水平見表2。設(shè)計L9(34)的正交試驗，以多肽得率為評價指標(biāo)，確定最適蛋白酶最佳酶解工藝條件。

圖6 料液比對多肽得率的影響Fig．6Effects of ratio of material to liquid on yield of peptides

表2 正交設(shè)計優(yōu)化酶解工藝各因素和水平Tab．2Factors and levels of orthogonal design

3.3.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果與分析

酶解溫度、酶解時間、料液比和酶添加量4個因素對多肽得率指標(biāo)的影響程度是C＞B＞D＞A，而且4個因素對多肽得率的影響都是極顯著的(見表3～表5)。正交設(shè)計試驗優(yōu)化中性蛋白酶酶解貽貝制備抗氧化肽優(yōu)選工藝條件是A1B1C3D3，即酶解溫度45℃、酶解時間1 h、酶添加量1 500 U/g、料液比(g/mL)1∶5。

3.4 優(yōu)選酶解工藝條件驗證

中性蛋白酶在酶解溫度45℃、酶解時間1 h、酶添加量1 500 U/g、料液比(g/mL)1∶5的酶解條件下酶解貽貝肉得到的酶解產(chǎn)物，測其多肽得率是(73．62±0．86)mg/g，并與正交試驗組多肽得率數(shù)據(jù)比較(見表5)，可以看出在正交試驗優(yōu)化酶解工藝條件下多肽得率是最高的，所以可以確定優(yōu)化酶解工藝條件的結(jié)果是可信的。

3.5 魚糕中的貽貝抗氧化肽的抗氧化活性測定

通過檢測抗氧化肽抑制油脂酸敗和氧化作用來評價貽貝抗氧化肽在魚糕中的抗氧化活性。實驗以酸價和過氧化值為評價指標(biāo)，評價魚糕中的貽貝抗氧化肽的抗氧化活性，如表6。酸價是國標(biāo)中評價油脂酸敗的衛(wèi)生指標(biāo)，過氧化值是油脂氧化的主要初級產(chǎn)物，適合本實驗設(shè)計要求［14］。

表3 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Tab．3Design and results of orthogonal design

表4 多肽得率方差分析表Tab．4Variance analysis of peptide yield

從表6可看出，新鮮豬油的酸價和過氧化值都較低，分別只達(dá)0．189 KOH mg/g，過氧化值0．0302g/100g，都低于國標(biāo)要求(過氧化值≤0．2 g/100 g)［15］，是達(dá)標(biāo)的油脂。經(jīng)過實驗處理的油脂酸價和過氧化值都有上升，其中酸價增加幅度大。經(jīng)實驗組和對照組對比可推出，貽貝抗氧化肽有抑制油脂氧化和酸敗的作用(p＜0．05)，且抑制油脂氧化酸敗的作用效果隨貽貝抗氧化肽添加量的增加而提升。再通過過氧化值對比可發(fā)現(xiàn)添加量4%組與6%組的抑制作用效果等同(p＞0．05)，即在魚糕中貽貝抗氧化肽抑制油脂氧化添加量的極值為4%?？寡趸幕钚缘臏y定方法包括化學(xué)模型、食品模型和動物細(xì)胞模型三大類。食品模型方法是設(shè)定一種食品模型，抗氧化肽添加到食品模型中，檢測抗氧化肽對食品中油脂氧化的抑制效果，即可說明抗氧化肽具有抗氧化活性。本研究采用食品模型的方法檢測貽貝抗氧化肽添加到魚糕中的抗氧化活性，以此說明魚糕是具有抗氧化活性的功能性食品。

表5 正交試驗組與驗證組多肽得率對比表Tab．5Comparison of peptide yield in orthogonal experimental group and validation group

表6 油脂指標(biāo)數(shù)據(jù)對照表Tab．6Quality of lard in different groups

經(jīng)實驗可得，貽貝抗氧化肽在油炸高溫條件下可抑制油脂氧化和酸敗，由此可推斷貽貝抗氧化肽在魚糕中有抗氧化活性。說明貽貝抗氧肽添加到魚糜制品中研制的魚糕是具有抗氧化功能的食品。

4 結(jié)論

采用酶解法和正交設(shè)計試驗優(yōu)化中性蛋白酶酶解制備貽貝抗氧化肽，優(yōu)選酶解工藝條件為酶解溫度45℃、酶解時間1 h、酶添加量1 500 U/g、料液比(g/mL)1∶5，在此條件下酶解產(chǎn)物中的抗氧肽含量最高。在魚糕制作中加入含抗氧化肽的貽貝酶解產(chǎn)物，評價貽貝抗氧化肽在魚糕中對油脂的抗氧化效果，結(jié)果顯示添加量大于2%時有顯著效果，同時驗證添加貽貝抗氧肽的魚糕是具有抗氧化活性的功能性食品。

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Development of Mussel Antioxidant Peptides and Functional Kamaboko Gels

CHEN Weiming，YIN Meili，ZHONG Ji，ZHAO Huishuang，CHEN Lijiao*
(College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China)

Functional surimi products with antioxidant activities were developed in this study．The enzymolysis was applied to produce mussel antioxidant peptides and neutral protease was the best protease．The optimized conditions were obtained by the orthogonal design，which were enzymatic temperature 45℃，enzymatic time 1 h，the amount of enzyme 1 500 U/g，and the ratio of material to liquid 1∶5 g/mL．Under this optimized conditions，the yield of peptides was(73．62±0．86)mg/g．Frozen dried enzymatic hydrolysates(＞2%)had the antioxidant effects on lard in kamaboko gel and the variance analysis showed that it had the obvious antioxidant effects on lard．The results demonstrated that kamaboko gel including mussel antioxidant peptides is one kind of functional foods．

mussel;antioxidant peptides;functional food

檀彩蓮)

TS254．4;Q814．9

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 005

2095-6002(2016)06-0024- 07

2016-01- 11

陳衛(wèi)明，男，碩士研究生，研究方向為食品加工理論與應(yīng)用;

*陳麗嬌，女，研究員，主要從事水產(chǎn)品精深加工與貯藏、食品功能性成分研究與開發(fā)方面的研究。

。

陳衛(wèi)明，尹美麗，鐘機，等．酶解制備貽貝抗氧化肽與功能性魚糕的研制［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34(6):24-30．

CHEN Weiming，YIN Meili，ZHONG Ji，et al．Development of mussel antioxidant peptides and functional kamaboko gels［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):24-30．