符策奕，梁穎，許文佳，陳朝曼

(海南省藥品檢驗(yàn)所化妝品室，海南?？?70216)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)

符策奕，梁穎，許文佳，陳朝曼

(海南省藥品檢驗(yàn)所化妝品室，海南海口570216)

目的建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的定性、定量方法。方法樣品經(jīng)甲醇超聲提取，HLB固相萃取柱分離，再通過(guò)C18色譜柱(Kinetex C18 2.6 μm 100A100×2.10 mm)分離，采用電噴霧離子源及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的方法檢出限分別是0.82 mg/kg、0.84 mg/kg。溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的線性范圍均為0.02～4 μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5(rBG= 1.000 0，rBB=0.999 9)，在不同劑型的化妝品中平均回收率在98.0%～109%范圍內(nèi)。結(jié)論該方法具有前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的測(cè)定。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；化妝品；溴甲酚綠；溴百里酚藍(lán)

隨著近年來(lái)人民生活水平的不斷提高，化妝品也逐步走進(jìn)千家萬(wàn)戶，但化妝品帶來(lái)的過(guò)敏性疾病數(shù)量也在不斷增加，這已成為過(guò)敏性皮炎的主要來(lái)源之一[1-3]。為了帶給消費(fèi)者更好的感官效果，化妝品中往往添加各種著色劑，而禁限著色劑濫用的情況同樣存在[4-5]。溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)屬于具有刺激性的著色劑，溴甲酚綠(Xi)屬于R36類(lèi)化學(xué)品，即具有刺激眼睛系統(tǒng)功能；溴百里酚藍(lán)屬于S24/25類(lèi)化學(xué)品，應(yīng)避免眼睛和皮膚接觸。在我國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007年版與歐盟化妝品檢測(cè)指導(dǎo)書(shū)(No：1223/ 2009)中規(guī)定溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)專(zhuān)用于僅和皮膚暫時(shí)接觸的化妝品(Rinse-off product)[6-7]。目前我國(guó)尚未建立化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的檢測(cè)方法，因此市面上的產(chǎn)品是否添加了上述限用的著色劑無(wú)法獲得準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[8-11]。

本文擬建立一種適用于化妝品的溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)檢測(cè)方法以監(jiān)測(cè)上述著色劑在化妝品中的使用情況，為上述限用物質(zhì)的監(jiān)督檢查提供必要依據(jù)。為了保證新建方法不受到各種原輔料的干擾，提高方法的專(zhuān)屬性，本文采用固相萃取柱與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀相結(jié)合的方式對(duì)多種不同類(lèi)型的基質(zhì)樣品進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備Thermo U3000液相色譜串聯(lián)AB APΙ4000+質(zhì)譜儀；色譜柱:Phenomenex Kinetex C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；Mili-Q超純水器(Millipore)；電子分析天平(Mettler Toledo AL204)；超聲波提取儀(KUDOS SK8210LHC)。

1.1.2 試劑與耗材乙腈(LC-MS級(jí)，Merk)、甲醇(LC-MS級(jí)，Merk)、甲酸(色譜級(jí)，TEDΙA)、水(超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm)、HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，Oasis)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溴甲酚綠(Bromocresol green，sigma，以干品計(jì)含量為95.4%)、溴百里酚藍(lán)(Bromothymol Blue，sigma，以干品計(jì)含量為95%)。取溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解稀釋成含量約2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)儲(chǔ)備液。再用甲醇配制成溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)濃度分別為202.1 μg/mL、207.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于-20℃保存。

1.2 前處理方法精密稱(chēng)取樣品約0.5 g，置25 mL比色管中加甲醇20 mL，振蕩渦旋1 min，使樣品與溶劑充分混勻，超聲提取20 min后放冷至室溫再用甲醇定容至刻度，混勻后精密量取上述樣品液1 mL置活化好的HLB固相萃取柱中，以1滴/2s的速度過(guò)柱，再用甲醇3 mL分3次洗滌固相萃取柱，抽干。收集從上樣到抽干全過(guò)程的洗脫液，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得樣品供試液。HLB柱使用前分別依次用5 mL甲醇、5 mL水、3 mL甲醇活化，并保持柱體濕潤(rùn)。

1.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：KΙNETEX C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸甲醇，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫：0～5 min，50%A；5～10 min，50%～85%A；10～15 min，85%A；15～16 min，85%～50%A；16～25 min，50%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件ESΙ為正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，離子噴霧電壓為4 500 V，離子源溫度(TEM)550℃，簾氣(CUR)15 psi，碰撞氣(氮?dú)?，霧化氣(GS1)55 psi，輔助氣(GS2)55 ps，分析目標(biāo)化合物的去簇電壓(DP)與碰撞能量(CE)值見(jiàn)表1、圖1。

表1 溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的質(zhì)譜分析條件

圖1 溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

1.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 線性與檢出限取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，配制溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)目標(biāo)濃度在0.02～20 μg/mL之間的8個(gè)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)峰峰面積為y，質(zhì)量濃度為x(μg/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至各個(gè)化合物最低響應(yīng)色譜峰信噪比(S/N)為3～4的濃度，再以此濃度折算方法檢出限(LOD)。

1.4.2 加樣回收率與精密度取空白的香水、護(hù)膚水、啫喱、潔面膏和粉底分別加入50 μL、100 μL、200 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，使低、中、高三個(gè)濃度的溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的添加量為約20 mg、40 mg、80 mg/kg，于暗處?kù)o置3 h后按上述前處理方法處理并進(jìn)樣分析。將回收率按液體、半固體、固體進(jìn)行分類(lèi)平均并計(jì)算每一類(lèi)別中總的加標(biāo)回收精密度(RSD%)。

1.4.3 實(shí)際樣品檢測(cè)選取從海南各市縣市場(chǎng)上采購(gòu)的各類(lèi)樣品共54批樣品采用上述前處理方法處理并進(jìn)樣分析。實(shí)際樣品涉及：香水、護(hù)膚水、花露水、美白乳膏、防曬霜、育發(fā)液、燙發(fā)液、脫毛膏、洗發(fā)水、洗面奶、面膜、粉底、眼影等類(lèi)型產(chǎn)品。

2 結(jié)果

2.1 線性與檢出限采用本方法測(cè)定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的方法檢出限分別為0.82 mg/kg、0.84 mg/kg，可滿足現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)要求，且線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，可用于定量測(cè)定。實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02～20 μg/mL范圍內(nèi)溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 7，但由于增加20 μg/mL濃度點(diǎn)后線性方程的截距均大于0.02 μg/mL濃度的色譜峰響應(yīng)值，因此僅建立0.02～4 μg/mL的線性方程，見(jiàn)表2。

表2 溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2 加樣回收率與精密度溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)在三大類(lèi)不同化妝品中平均添加回收率的范圍是98.0%～109%，精密度(RSD%)值均小于6.0%，說(shuō)明本方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，見(jiàn)表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果經(jīng)測(cè)試共54批不同品牌規(guī)格的實(shí)際樣品，結(jié)果未見(jiàn)有基質(zhì)干擾情況，樣品也均未檢出溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)?？梢?jiàn)目前海南化妝品市場(chǎng)上并未出現(xiàn)溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)大規(guī)模濫用情況。

2.4 前處理方法的選擇實(shí)驗(yàn)考察了水、50%甲醇、甲醇、乙腈作為提取溶劑提取樣品時(shí)的效果，結(jié)果甲醇效果最佳，且如果使用50%甲醇或水稀釋樣品供試液時(shí)，部分樣品會(huì)因?yàn)檩o料的析出而導(dǎo)致溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)回收率顯著降低。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，以潔面膏為基質(zhì)本底超聲提取20 min溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)提取回收率效果最佳，延長(zhǎng)時(shí)間非但不可提高提取效果，反而會(huì)導(dǎo)致回收率降低，見(jiàn)圖2。為保護(hù)色譜柱性能，避免不溶物對(duì)色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析穩(wěn)定性的影響，樣品前處理時(shí)擬采用有機(jī)膜過(guò)濾樣品供試液。但溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)經(jīng)有機(jī)膜過(guò)濾后會(huì)導(dǎo)致回收率顯著降低。經(jīng)測(cè)試在0.16 μg/mL濃度時(shí)溴百里酚藍(lán)用0.45 μm(尼6)有機(jī)濾膜棄去8 mL初濾液后回收率方達(dá)90%以上，但溴甲酚綠棄去8 mL初濾液質(zhì)譜儀仍無(wú)任何響應(yīng)，因此放棄使用有機(jī)膜過(guò)濾樣品供試液的方案。考慮到有機(jī)濾膜過(guò)濾會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物被吸附，離心對(duì)部分樣品不適用，因此擬采用固相萃取技術(shù)純化樣品供試液后直接檢測(cè)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)HLB固相萃取柱采用甲醇洗滌1 mL時(shí)，溴百里酚藍(lán)回收率可達(dá)90%，溴甲酚綠回收率僅有35%，洗滌3 mL時(shí)兩種組分回收率均在95%以上，因此選擇甲醇洗滌3 mL為洗脫條件。

圖2 不同超聲時(shí)間提取回收率

2.5 質(zhì)譜與色譜條件的選擇經(jīng)測(cè)試甲醇、乙腈、水、甲酸水、乙酸水、乙酸銨水的不同組合，結(jié)果0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水色譜體系色譜峰峰形、分離度相對(duì)較好。為了保證實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，色譜系統(tǒng)在16～25 min平衡色譜系統(tǒng)9 min。將濃度為20 μg/mL的溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)通過(guò)蠕動(dòng)泵與流動(dòng)相分別注入質(zhì)譜，確定特征離子與去簇電壓、碰撞能量等關(guān)鍵參數(shù)。結(jié)果上述兩種組分均在ESΙ(+)模式下獲得具有較高響應(yīng)的(M+H)+分子離子峰，因此本文選用ESΙ (+)為離子源電離模式，以(M+H)+為分子離子峰進(jìn)行分析。雖然由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中溴元素的存在，這兩種組分均有較高的同位素響應(yīng)峰，但為了保證待測(cè)物的專(zhuān)屬性，本文未選用同位素峰作為定性離子峰，而選擇其他響應(yīng)較強(qiáng)的碎片峰進(jìn)行定性，本文選定的MRM離子對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖

3 結(jié)論

建立了一種固相萃取結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的方法，并采用該方法對(duì)5類(lèi)不同劑型的香水、護(hù)膚水、潔面膏、啫喱和粉底等產(chǎn)品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)和54批從海南各市縣采集的不同來(lái)源實(shí)際樣品測(cè)試實(shí)驗(yàn)。結(jié)果加標(biāo)實(shí)驗(yàn)平均回收率達(dá)到98.0%～109%。實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果均未檢出溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)，可見(jiàn)目前海南化妝品市場(chǎng)上尚未出現(xiàn)大規(guī)模違禁添加溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)的情況。

綜上所述，本研究建立了一種前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，專(zhuān)屬性強(qiáng)，基質(zhì)干擾低，具有很強(qiáng)實(shí)用性的溴甲酚綠與溴百里酚藍(lán)檢測(cè)方法，為針對(duì)上述化合物在化妝品中濫用情況的監(jiān)督檢查提供可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。

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Simultaneous determination of bromocresol green and bromothymol blue in cosmetics by high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry.

FU Ce-yi,LIANG Ying,XU Wen-jia,CHEN Chao-man. Laboratory of Cosmetics,Hainan Provincial Institute for Drug Control,Haikou 570216,Hainan,CHINA

ObjectiveTo develop the high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous determination of bromocresol green(BCG)and bromothymol blue(BTB)in cosmetics. MethodsThe cosmetic sample was extracted with methanol under ultrasonication,and separated by HLB solid phase extraction.The extracted complexes were separated on a C18 column(Kinetex C18,2.6 μm,100 A,100×2.10 mm),and identified under electrospray ionization and multiple reactions monitoring(MRM)mode.ResultsThe LODs of BCG and BTB are respectively 0.82 mg/kg and 0.84 mg/kg.Calibration curves were linear in the range of 0.02～4 μg/mL for BCG and BTB,with the correlation coefficients greater than 0.999 5(rBG=1.000 0,rBB=0.999 9).The average recoveries of BCG and BTB in different dosage forms of cosmetics ranged from 98.0%to 109%.ConclusionThe method is simple sensitive and accurate,which adapts to simultaneous determination of BCG and BTB in cosmetics.

HPLC-MS/MS;Cosmetics;Bromocresol green(BCG);Bromothymol blue(BTB)

R446

A

1003—6350（2016）13—2150—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.030

2016-01-21)

符策奕。E-mail：xf_vicar@126.com。