楊佳純，張毅，曹佳，徐雷鳴

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200092)

DDR1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1的遷移及侵襲能力

楊佳純，張毅，曹佳，徐雷鳴

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200092)

目的探討盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。方法利用qRT-PCR檢測(cè)DDR1在胰腺癌旁組織及癌組織中的表達(dá)水平。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1表達(dá)質(zhì)粒至胰腺癌細(xì)胞AsPC-1中，應(yīng)用Western blot驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效果。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染DDR1表達(dá)質(zhì)粒后細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化情況。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)水平。結(jié)果與癌旁組織比較，胰腺癌組織的DDR1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，AsPC-1細(xì)胞DDR1蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。應(yīng)用劃痕試驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AsPC-1/DDR1遷移力上調(diào)(51.11±11.51)%，侵襲力上調(diào)(77.25±10.64)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。過(guò)表達(dá)DDR1后，AsPC-1細(xì)胞中MMP2和MMP9表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論DDR1通過(guò)改變MMP2和MMP9的表達(dá)水平，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲，有望成為靶向治療的新方向。

盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1；胰腺癌；遷移；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶2；基質(zhì)金屬蛋白酶9

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年升高，五年生存率通常不超過(guò)5%。并且，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，常伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，在分子靶向治療方面取得新的成果，對(duì)提高患者的生存時(shí)間具有重要的意義[1-3]。

盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1(Discoidin domain receptor 1，DDR1)作為一種受體型酪氨酸激酶，在許多惡性腫瘤中異常表達(dá)。其主要通過(guò)調(diào)控膠原蛋白的合成和降解，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和基質(zhì)重塑[4]。因此，本研究通過(guò)DDR1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AsPC-1中，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響以及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)表達(dá)情況的影響，探討DDR1是否通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，參與胰腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1購(gòu)于上海中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。pcDNA3.1/DDR1質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司。Transwell購(gòu)于美國(guó)Corning公司。兔抗人單克隆抗體DDR1購(gòu)于美國(guó)CST公司。兔抗人多克隆抗體MMP2、兔抗人多克隆抗體MMP9均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。放置于37℃，5%CO2恒濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作流程參照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染72 h后提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.4 Real-time PCR法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；虮磉_(dá)通過(guò)2′-△△CT方法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物：DDR1上游：5′-GGTGCTGATGCTCTGTAGGG-3′；DDR1下游：5′-CGTGTTGAGTGCATCCTCTG-3′。

1.5 Western blot法將細(xì)胞加至含有PMSF的蛋白裂解液，冰上放置45 min，低溫離心，提取上清。并根據(jù)BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取60～80 μg總蛋白，配制10%聚丙烯酰胺凝膠，80 V 120 min進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA 100 min。含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2.5 h，TBST洗3遍，加入DDR1抗體(1:1 000)，MMP2抗體(1:500)，MMP9抗體(1:200)及tubulin抗體(1:1 000)，4℃冰箱過(guò)夜，TBST洗3遍，分別加入相應(yīng)二抗(1:1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3遍，ECL發(fā)光液發(fā)光。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將AsPC-1細(xì)胞接種于12孔板，轉(zhuǎn)染后用100μl的槍頭做十字劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，加入正常培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h、72 h拍照。

1.7 細(xì)胞遷移及侵襲力檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h的AsPC-1細(xì)胞消化離心，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/ml。每孔上室加入100μl，下室加入500μl含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24～36 h后取出小室，棄去培養(yǎng)基，用棉簽蘸清水擦拭小室內(nèi)的殘余細(xì)胞。甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并隨機(jī)計(jì)算8個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell小室包被Matrigel基質(zhì)膠80μl(1:4稀釋)，37℃孵育6 h。在上室及下室均加入500μl無(wú)血清培養(yǎng)基置4℃過(guò)夜。余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。兩組實(shí)驗(yàn)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌及癌旁組織DDR1的表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果示，胰腺癌組織中DDR1的表示水平顯著高于癌旁組織(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)DDR1 mRNA在胰腺癌癌旁組織及癌組織中表達(dá)情況

2.2 DDR1轉(zhuǎn)染AsPC-1后蛋白表達(dá)水平DDR1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AsPC-1，AsPC-1/DDR1的相對(duì)蛋白表達(dá)量為(2.55±0.55)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況

2.3 DDR1過(guò)表達(dá)后AsPC-1細(xì)胞遷移能力變化與對(duì)照組比較，DDR1質(zhì)粒組在0 h、24 h、48 h、72 h的胰腺癌細(xì)胞AsPC-1遷移能力顯著提高，見(jiàn)圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對(duì)照組比較，AsPC-1細(xì)胞遷移力上升(51.11±11.51)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞體外遷移能力的影響

圖4 Transwell檢測(cè)DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞體外遷移能力影響

2.4 DDR1過(guò)表達(dá)后AsPC-1細(xì)胞侵襲能力變化采用侵襲實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組比較，DDR1表達(dá)上調(diào)后穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，AsPC-1細(xì)胞侵襲力增加(77.25±10.64)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞體外侵襲能力的影響

2.5 DDR1過(guò)表達(dá)后AsPC-1細(xì)胞MMP2、MMP9表達(dá)情況Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MMP2和MMP9的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AsPC-1/ DDR1組的MMP2和MMP9蛋白水平顯著升高，見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)DDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)MMP2和MMP9表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過(guò)程。胰腺癌作為一種消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移早、進(jìn)展快、預(yù)后非常差的特點(diǎn)。因此，進(jìn)一步研究與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為今后靶向治療提供理論依據(jù)[5]。

DDR1作為一種酪氨酸激酶，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，其可以通過(guò)與腫瘤細(xì)胞周圍膠原蛋白相互作用，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。在胰腺癌方面，研究發(fā)現(xiàn)，DDR1異常表達(dá)于胰腺癌患者中，且與其預(yù)后有著密切的關(guān)系[8]。在機(jī)制方面，I型蛋白膠原可以與DDR1或整合素相互作用，通過(guò)p130CAS-Rap1-MLK3-MKK7-JNK1-cJun信號(hào)通路，上調(diào)N-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞擴(kuò)散[9]。COLXV通過(guò)與DDR1相互結(jié)合，直接作用于E-cadherin，抑制COLI介導(dǎo)的細(xì)胞散射，從而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力[10]。在DDR1治療方面，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種選擇性DDR1抑制劑——DDR1-IN-1，其可抑制DDR1發(fā)生自身磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，有望成為DDR1過(guò)表達(dá)或突變的腫瘤治療探針[11]?？梢?jiàn)，DDR1在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用。

本研究將DDR1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入AsPC-1細(xì)胞中，旨在研究外源性過(guò)表達(dá)DDR1對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，DDR1過(guò)表達(dá)于胰腺癌組織中。胰腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)DDR1后，MMP2和MMP9的表達(dá)亦顯著升高，促進(jìn)AsPC-1的遷移及侵襲能力。

綜上所述，在胰腺癌細(xì)胞中，DDR1通過(guò)調(diào)節(jié)MMP2和MMP9的表達(dá)增強(qiáng)其遷移及侵襲能力。

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Up-regulating effect of DDR1 on migration and invasion of human pancreatic cancer cell line AsPC-1.

YANG Jia-chun,ZHANG Yi,CAO Jia,XU Lei-ming.Department of Gastroenterology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of discoidin domain receptor 1(DDR1)on the migration and invasion of human pancreatic cancer cell line AsPC-1.MethodsThe expressions of DDR1 mRNA in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues were determined by real-time PCR.The expressions of DDR1,matrix metalloproteinase 2 (MMP2)and matrix metalloproteinase 2(MMP9)were detected by Western blot after the DDR1 expression plasmid was transfected into AsPC-1 cell line.The ability of migration and invasion was determined by Wound Healing and Transwell.ResultsThe expression of DDR1 mRNA in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues(P＜0.05).After the DDR1 plasmid was transfected into AsPC-1,the protein expression of DDR1 was significantly up-regulated(P＜0.05).Compared with cells transfected with empty vector(control),the ability of migration and invasion for cells transfected with DDR1 plasmid were increased by(51.11±11.51)%and(77.25±10.64)%,and the expression levels of MMP2 and MMP9 after overexpression of DDR1 were also significantly up-regulated.The differences were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionDDR1 can promote the migration and invasion of human pancreatic caner cell line AsPC-1 via up-regulating the expressions of MMP2 and MMP9.It could be considered as a potential target for gene therapy for pancreatic cancer.

Discoidin domain receptor 1(DDR1);Pancreatic cancer;Migration;Invasion;Matrix metalloproteinase 2(MMP2);Matrix metalloproteinase 2(MMP9)

R735.9

A

1003—6350（2016）02—0173—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.001

2015-09-21)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(編號(hào)：81301826)

徐雷鳴。E-mail：leiming.xu@aliyun.com；曹佳。E-mail：76333336@qq.com。