王浩平，鄭淑華，穆小萍，黃瑞玉，盧春敏

(1.廣東省人民政府機(jī)關(guān)門診部，廣東廣州510030；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東廣州511400)

硝酸鎵和多黏菌素B抑制耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長的作用

王浩平1，鄭淑華2，穆小萍2，黃瑞玉2，盧春敏2

(1.廣東省人民政府機(jī)關(guān)門診部，廣東廣州510030；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東廣州511400)

目的評價硝酸鎵和多黏菌素B對臨床分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長的抑制作用，分析其抗菌機(jī)制。方法采用微量稀釋法檢測硝酸鎵和多黏菌素B對20株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的抑制作用，觀察兩者聯(lián)合應(yīng)用的抑菌情況。結(jié)果試驗菌株對硝酸鎵和多黏菌素B均敏感，硝酸鎵對試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)均為16 μmol/L，多黏菌素B對試驗菌株的MIC均為≤2.0 μg/ml，兩者聯(lián)合應(yīng)用對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長有協(xié)同抑菌作用。結(jié)論硝酸鎵和多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有明顯抑菌效果，有望成為控制其蔓延感染有效的治療藥物，為臨床治療這類難治細(xì)菌感染提供藥物選擇。

硝酸鎵；多黏菌素B；碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌；抑制作用

碳?xì)涿瓜╊愂侵委燉U曼不動桿菌嚴(yán)重感染的主要藥物，近年來此類藥物的廣泛使用，使得鮑曼不動桿菌對碳青酶烯類的耐藥率不斷上升，給臨床治療帶來極大困難[1-2]，因而尋求一種有效的抗菌藥物或新的治療方法尤其重要。鐵離子是細(xì)菌生長的必須營養(yǎng)品，硝酸鎵可通過干擾細(xì)菌的鐵離子代謝而實現(xiàn)抑菌作用[3-4]，多黏菌素B對細(xì)菌外膜具有快速穿透性的特點，亦可輔助其他抗菌藥物穿透細(xì)菌外膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)[5]，以達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用，本研究應(yīng)用硝酸鎵和多黏菌素B作用于鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥株，觀察兩者是否對其有抑制生長的效果，以及兩者聯(lián)合應(yīng)用的抑菌情況，探求能否將硝酸鎵和多黏菌素B作為一種臨床有效的抗菌方法。

1 材料與方法

1.1 菌株來源菌株來自廣東省婦幼保健院檢驗科2012年1月至2014年12月的臨床患者標(biāo)本分離株20株，經(jīng)法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact鑒定系統(tǒng)和藥敏試驗鑒定并確定為碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌，菌株間沒有重復(fù)株。

1.2 試劑與儀器培養(yǎng)基胰酶大豆肉湯(TSB)購自美國BD公司產(chǎn)品，硝酸鎵購自Sigma-Aldrich公司，多黏菌素B購自美國Amresco公司，無菌96孔聚苯乙烯U型微量板為德國Greiner產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為Thermo M ΜLTISKAN MK3。

1.3 方法

1.3.1 硝酸鎵和多黏菌素B藥物濃度配制采用倍比稀釋方法，用TSB將硝酸鎵稀釋成一系列不同濃度，由高到低依次為64 μmol/L、32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L，用相同方法將多黏菌素B稀釋到濃度分別為8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。

1.3.2 硝酸鎵和多黏菌素B的抑菌活性檢測采用微量肉湯稀釋法，各試驗菌株接種TSB，37℃孵育8 h，用生理鹽水將菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用TSB稀釋1:100，使含菌量為106CFU/ml，然后在無菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接種100 μl菌液，設(shè)置上下復(fù)孔，第一孔加入無菌液培養(yǎng)基為空白對照，第二孔加入不含藥物菌液為陽性對照，第三孔至第八孔各孔加入上述配制好的藥物100 μl，使硝酸鎵藥物終濃度依次為32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L，多黏菌素B藥物終濃度依次為4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml、0.125 μg/ml，將微孔板震蕩1 min，使各孔內(nèi)溶液混勻，加蓋并用膠紙密封以減少孵育過程中的蒸發(fā)，置濕盒內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后檢測菌液OD600的值，觀察不同藥物濃度的抑菌情況，以試驗孔中無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該藥物的MIC值。

1.3.3 硝酸鎵和多黏菌素B聯(lián)合應(yīng)用抑菌試驗采用微量肉湯稀釋法，在無菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接種100 μl菌液，將上述配好的不同濃度的硝酸鎵和多黏菌素B兩種藥物按棋盤法設(shè)計，兩兩組合各加入50 μl，使得每個U型孔中含有不同濃度的硝酸鎵與多黏菌素B，及單獨含有不同濃度的單藥硝酸鎵與多黏菌素B，同時加入無菌液培養(yǎng)基設(shè)置空白對照孔，加入不含藥物菌液設(shè)置陽性對照孔，震蕩混勻，加蓋并用膠紙密封以減少孵育過程中的蒸發(fā)，置濕盒內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后檢測菌液OD600的值，觀察硝酸鎵和多黏菌素B聯(lián)合應(yīng)用對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的抑菌情況。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鎵的抑菌活性結(jié)果顯示硝酸鎵有抑制各株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌生長的作用，各菌株的抑制效果無差異，抑制活性曲線呈現(xiàn)一致性，當(dāng)硝酸鎵濃度＞16 μm/L時，基本檢測不到病原菌的存在，其MIC值為16 μm/L。菌液濃度監(jiān)測變化趨勢見圖1。

圖1 硝酸鎵抑菌活性曲線

2.2 多黏菌素B的抑菌活性多黏菌素B能抑制各株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的生長，且抑菌效果接近，20株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對多黏菌素B的MIC值均≤2 μg/ml，MIC值分布情況為0.5 μg/ml 6株、1.0 μg/ml 12株、2.0 μg/ml 2株。抑菌活性曲線，見圖2。

圖2 多黏菌素B抑菌活性曲線

2.3 硝酸鎵和多黏菌素B協(xié)同抑菌作用結(jié)果顯示在碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌活性試驗中，硝酸鎵和多黏菌素B聯(lián)合應(yīng)用能互相增強(qiáng)抑菌效果，當(dāng)硝酸鎵終濃度為4 μmol/L，多黏菌素B終濃度為0.25 μg/ml時，基本檢測不到病原菌的存在，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用的MIC值均比單藥MIC值小，曲線見圖3。

圖3 硝酸鎵和多黏菌素B協(xié)同抑菌作用曲線圖

3 討論

鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，而碳?xì)涿瓜╊愂侵委燉U曼不動桿菌嚴(yán)重感染的首選藥物，但是，近年來隨著亞胺培南、美羅培南等碳青酶烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，其耐藥率呈上升趨勢，文獻(xiàn)報道鮑曼不動桿菌耐碳青酶烯類抗菌藥物日益增多[1-2]，目前臨床針對此類耐藥菌株的抗生素治療手段極其有限，給臨床治療帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

鐵離子是鮑曼不動桿菌的重要營養(yǎng)品，可以保持菌體內(nèi)各類酶的活性并產(chǎn)生細(xì)菌毒素，酶類的激活需要鐵離子的參與，如果缺乏鐵離子則酶的活性將受到影響，甚至影響細(xì)菌發(fā)揮毒性作用[3-4]，由此可見鐵對鮑曼不動桿菌來說非常重要，因此本文考慮將鐵離子去除而抑制細(xì)菌生長，抑制其發(fā)揮毒性作用，而硝酸鎵的鎵離子可以與鐵離子競爭，限制細(xì)菌對鐵的攝取和利用，干擾細(xì)菌鐵代謝途徑而抑制其生長，具有較強(qiáng)的抗菌作用。多黏菌素B是多粘芽胞桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素，主要通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)細(xì)菌主要物質(zhì)外漏，影響核質(zhì)和核糖體功能，具有較強(qiáng)的殺菌作用并且不容易產(chǎn)生耐藥性，多數(shù)文獻(xiàn)也報道多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的生長有明顯抑制作用[5-6]。

本研究結(jié)果顯示硝酸鎵和多黏菌素B對各株臨床標(biāo)本分離的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌有明顯的體外抑制生長作用，兩者同時作用于耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌，具有協(xié)同抑菌作用。硝酸鎵的鎵離子半徑和效價與三價鐵離子一樣，鮑曼不動桿菌的生物反應(yīng)系統(tǒng)無法區(qū)分兩種離子，可以用鎵離子模仿三價鐵離子與細(xì)菌體內(nèi)的各種酶結(jié)合，使到需要鐵離子激活的所有酶均不能正常激活而失去生物學(xué)功能，最終通過干擾細(xì)菌鐵離子代謝途徑實現(xiàn)其抑菌功能，從而抑制鮑曼不動桿菌的生長[7-8]。多黏菌素B通過破壞鮑曼不動桿菌的細(xì)胞膜，對細(xì)菌外膜具有快速穿透性的特點，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)主要物質(zhì)外漏[9]，破壞鮑曼不動桿菌的生物功能，同時細(xì)胞膜破壞后，可輔助硝酸鎵穿透細(xì)菌外膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，替換鐵離子，干擾細(xì)菌體內(nèi)的鐵代謝途徑，使碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌菌體內(nèi)大部分酶因不能正常激活而發(fā)揮不了作用，最終抑制細(xì)菌生長，表現(xiàn)出硝酸鎵和多黏菌素B兩者聯(lián)合使用的協(xié)同作用，同時可減少各自的使用量，降低藥物腎臟損害的程度，從而解決耐藥菌的治療問題。

目前鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥率呈現(xiàn)上升的趨勢，臨床治療也出現(xiàn)困難，本研究從另一個角度考慮如何治療耐藥的鮑曼不動桿菌的感染，硝酸鎵聯(lián)合多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有明顯的協(xié)同抑制生長作用，有望成為控制其蔓延感染有效的治療藥物，為臨床治療這類難治細(xì)菌感染提供藥物選擇。

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Inhibitory effect of gallium nitrate and polymyxin B on the growth of carbapenem-resistant Acinetobacterbaumannii.

WANG Hao-ping1,ZHENG Shu-hua2,MU Xiao-ping2,HUANG Rui-yu2,LU Chun-min2.1.Outpatient Department,Guangdong Provincial People's Government,Guangzhou 510030,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the ability of gallium nitrate and polymyxin B for inhibiting the growth of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients,and to analyze their mechanisms.MethodsThe inhibitory activity of gallium nitrate and polymyxin B against 20 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains was tested by using microtiter plates.The activity of the combination of gallium nitrate and polymyxin B was also observed.ResultsThe tested strains were sensitive to gallium nitrate and polymyxin B.The minimum inhibitory concentration(MIC)of gallium nitrate was 16 μmol/L,and the MIC of polymyxin B was less than 2.0 μg/ml.Synergistic inhibitory effect for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was observed when gallium nitrate and polymyxin B were applied in combination.ConclusionThe bacteriostasis of gallium nitrate and polymyxin B for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was obvious.It could be used for controlling the infection of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.

Gallium nitrate;Polymyxin B;Carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii;Inhibitory effect

R378

A

1003—6350（2016）01—0073—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.026

2015-08-21)

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(編號：A2013173)

王浩平。E-mail：489611421@qq.com