韓蕓，王強

(什邡市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科1、檢驗科2，四川 什邡 618400)

Id-2在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

韓蕓1，王強2

(什邡市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科1、檢驗科2，四川 什邡 618400)

目的 探討分化抑制因子2(Id-2)在人結(jié)直腸癌組織中的表達及其與患者臨床病理參數(shù)和預后的關(guān)系。方法選擇2013年1月至2015年6月在我院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者56例為研究對象。采用免疫組織化學法檢測所有患者腸癌組織和其中26例患者癌旁正常腸上皮組織中Id-2的表達水平，比較陽性與陰性表達者間的年齡、性別、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后的差異。結(jié)果免疫組織化學染色顯示，Id-2主要表達于胞漿，其在腸癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為64.3%(36/56)和34.6%(9/26)，癌組織陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；臨床病理特征分析顯示，在結(jié)直腸癌中，Id-2陽性表達與患者TNM分期(P＜0.05)、病理分級(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關(guān)，陽性患者Ⅲ～Ⅳ、低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例明顯高于陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；Id-2陽性患者的中位無疾病進展生存時間為24.7個月，陰性患者為38.5個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(HR=2.23，95%CI：1.02～4.87，P＜0.05)。結(jié)論Id-2蛋白可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且陽性患者預后較差。

結(jié)直腸癌；分化抑制因子2；免疫組織化學；臨床病理參數(shù)；生存時間

分化抑制因子2(Inhibitor of differentiation 2，Id-2)屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)蛋白家族的Id家族成員，分子生物學功能研究顯示，其能夠負性調(diào)控bHLH轉(zhuǎn)錄因子的活性[1]。因而在腫瘤細胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有總要功能。近年來研究顯示Id-2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達并與患者的預后不良有關(guān)[2-3]。本研究采用免疫組織化學SP法檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中Id-2表達水平探討其與患者臨床特征及預后的關(guān)系，為臨床結(jié)直腸癌的診治及預后工作提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年6月我院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者56例為研究對象。采用免疫組織化學法檢測所有患者腸癌組織和其中26例患者癌旁正常腸上皮組織中Id-2的表達水平。病例納入標準：術(shù)后病理學確診為結(jié)直腸癌；臨床病例資料完整；有隨訪數(shù)據(jù)；組織病理標本獲取經(jīng)家屬書面同意。排除標準：術(shù)前接受過新輔助放化療或生物治療者；病理學診斷不明確者；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；臨床病理資料不全者。56例結(jié)直腸癌患者中男性31例，女性25例，平均年齡(57.2±16.6)歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期31例。

1.2 儀器與試劑 石蠟切片機(購自德國徠卡公司)；顯微鏡(購自日本奧林巴斯公司)、電熱恒溫箱(上海榮珂檢測儀器有限公司生產(chǎn))、微波爐，臺式離心機(購自BechmanCoulter公司)。

1.3 主要試劑 鼠抗人Id-2多克隆抗體購自北京中杉金橋有限公司；即用型免疫組織化學法試劑盒購自上海美軒生物科技公司；DAB顯示試劑盒購自北京中杉金橋有限公司；以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，以已知陽性對照片為陽性對照。

1.4 Id-2免疫組化檢測 脫蠟和水化：腫瘤組織石蠟包埋后進行組織切片(4～7 μm)，然后二甲苯洗滌切片3次，每次5 min進行脫蠟；接著分別用100%和95%的乙醇洗滌切片各3次，每次5 min，進行水化。滅活內(nèi)源性過氧化物酶：將切片置于3%H2O2: (30%H2O2:甲醇=l:9)中，避光孵育15 min；dH2O潤洗5 min?？乖迯停簩⑶衅糜诳乖迯鸵?濃縮液:水=15 mL:1 600 mL)中，微波修復25 min，在微波過程中應(yīng)隨時加滿抗原修復液，5 min加一次。洗滌：室溫冷卻20 min，以蒸餾水沖洗后，用TBST洗滌兩次，每次5 min。封閉：用100 μL含10%的正常驢血清(TBST稀釋)將滴在組織處，并用剪切好的衛(wèi)生紙覆蓋，濕盒里孵育1 h。加一抗：加入實驗所需一抗，用10%血清稀釋到合適的終濃度，滴在組織處，并用衛(wèi)生紙覆蓋放入濕盒中，4℃孵育過夜，同時以同型抗體作為陰性對照。洗滌：用TBST洗滌3次，每次15 min。加二抗：加入HRP標記的二抗(稀釋比例為1:100)，室溫孵育1 h。顯色：根據(jù)實驗中所用的顯色試劑盒，根據(jù)要求操作。一般可用親和素生物素過氧化物酶復合物(ABC)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色。蘇木精復染：用蘇木精染核2～4 min。反藍：用1%鹽酸處理1 min。洗滌封片：dH2O洗滌2次，5～10 min，封片，干燥后顯微鏡先觀察拍照。

1.5 陽性結(jié)果判定[4]采用雙盲法對染色結(jié)果進行判定，在顯微鏡下每張載玻片計數(shù)5個視野，計數(shù)每個視野中細胞總數(shù)及Id-2陽性的細胞數(shù)。陽性細胞均以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為主。陽性細胞＜5%為(-)；陽性細胞5%～25%為(+)；陽性細胞25%～50%為(++)；陽性細胞＞50%為(+++)。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率檢驗；生存分析采用風險比例模型Log-rank檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Id-2蛋白表達 免疫組織化學染色顯示，Id-2主要表達于胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)其在腸癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為64.3%(36/56)和34.6%(9/26)，癌組織顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。

圖1 Id-2蛋白在癌組織中的表達(×40)

2.2 Id-2表達與臨床病理參數(shù)關(guān)系 臨床病理特征分析顯示，在上結(jié)直腸癌中Id-2陽性表達與患者TNM分期(P＜0.05)、病理分級(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)(P＜0.05)移有關(guān)，陽性患者Ⅲ～Ⅳ、低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例明顯高于陰性者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 Id-2表達與患者預后 Id-2陽性患者的中位無疾病進展生存時間為24.7個月，陰性患者為38.5個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(HR=2.23，95%CI：1.02～4.87，P＜0.05)，見圖2。

圖2 Id-2表達與患者無疾病進展生存時間

表1 Id-2表達與臨床病理特征關(guān)系(例)

3 討 論

結(jié)直腸癌是臨床上較為常見的一類消化系統(tǒng)腫瘤，新近的腫瘤流行病學研究顯示，北美2012年新發(fā)結(jié)直腸癌患者約為14萬，死亡患者5萬，結(jié)直腸癌已成為美國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[5]。在我國尚缺乏相對完整的全國范圍內(nèi)實體腫瘤或結(jié)直腸癌流行病學數(shù)據(jù)，但區(qū)域性發(fā)病率研究顯示，近年來隨著人口老齡化的加劇、飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出了上升趨勢和年輕化趨勢[6]。目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病原因及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制并不十分清楚，但普遍認為其是一個涉及多個基因多個步驟的分子生物學過程，包括多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。

Id-2是1990年由Benezra等[7]發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，初期的研究結(jié)果認為其與腫瘤細胞的增殖和分裂有關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Id-2同時具有細胞周期調(diào)控和抑制細胞凋亡的功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞和組織中Id-2呈現(xiàn)高表達而在對應(yīng)的正常細胞或正常組織中呈現(xiàn)低表達，提示其在實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[8]。楊維群等[9]采用免疫組織化學檢測了122例食管鱗狀細胞癌及90例癌旁正常組織中Id-2的表達情況，結(jié)果顯示，食管鱗狀細胞癌中Id-2表達高于癌旁正常組織，且其陽性表達與腫瘤的分化程度和浸潤深度有關(guān)。因而，該研究認為Id-2是食管鱗癌一個重要的分子學改變，Id-2可作為判斷食管鱗狀細胞癌生物學行為的潛在指標。單鐵英等[10]探討了直腸癌組織中Id-2表達與患者臨床病理學參數(shù)的關(guān)系，該研究提示Id-2表達水平與直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系，直腸癌組織中Id-2高表達可能是通過MMP-9途徑來促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中Id-2陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，且陽性表達患者中低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例高于陰性患者，提示Id-2可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移過程，這與單鐵英等[10]的研究結(jié)論基本一致。同時我們根據(jù)患者腫瘤組織中Id-2的表達水平分為陰性組和陽性組，并采用Kaplan-meier風險比例模型探討了Id-2表達水平與患者無疾病進展生存時間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)陽性患者中位無疾病進展生存時間顯著低于陰性組，提示Id-2陽性患者預后不良，可作為轉(zhuǎn)移復發(fā)的生物學指標。

Id-2參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移已被多個研究證實，但其調(diào)控結(jié)直腸癌細胞惡性生物學行為的分子機制并不清楚。因此，應(yīng)進一步以各種實體腫瘤細胞系為研究對象，綜合采用多種分子生物學技術(shù)，在分子水平和體內(nèi)探討其調(diào)控細胞和生物體惡性表型的分子機制，為臨床結(jié)直腸腫瘤靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

[1]Mohamed JS,Lopez MA,Cox GA,et al.Ankyrin repeat domain protein 2 and inhibitor of DNA binding 3 cooperatively inhibit myoblast differentiation by physical interaction[J].J Biol Chem,2013,288 (34):24560-24568.

[2]楊維群,邱建龍,蔡玉梅,等.p53和Id2蛋白在食管鱗狀細胞癌的表達及其意義[J].解剖科學進展,2014,20(2):151-153,157.

[3]Nakashima A,Tamura M.Regulation of matrix metalloproteinase-13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 gene expression by WNT3A and bone morphogenetic protein-2 in osteoblastic differentiation[J].Front Biosci,2006,11:1667-1678.

[4]馬穎,楊向紅,林連捷,等.PTEN和Caspase-3在大腸癌中的表達及臨床意義[J].中國醫(yī)科大學學報,2010,39(4):290-292.

[5]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

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[9]楊維群,吳春林,蔡玉梅,等.食管鱗狀細胞癌組織中Id1和Id2的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2010,26(2):144-147.

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Clinical significance of inhibitor of differentiation 2 expression in colorectal cancer.

HAN Yun1,WANG Qiang2. Department of Oncology1,Department of Clinical Laboratory2,Shifang People's Hospital,Shifan 618400,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the association between inhibitor of differentiation 2(Id2)expression and clinical characteristic in patients with colorectal cancer.MethodsFifty-six patients with colorectal cancer,who underwent surgery in our hospital from Jan 2013 to Jun 2015,were enrolled in this study.The Id2 expression of 56 cases of cancer tissue and 26 cases of normal tissue were tested by immunohistochemistry.The associations between inhibitor of differentiation 2 expression and age,gender,pathology grading lymph node metastasis and prognosis in colorectal patients were analyzed.ResultsThe immunohistochemistry showed that Id2 was general expressed in the cytolymph.The positive expression rate of Id2 in cancer tissue[64.3%(36/56)]was significantly higher than that in normal tissue [34.6%(9/26)],P＜0.05.Clinical pathological features analysis showed a significant association between Id2 positive expression and clinical stage(P＜0.05),pathology grading(P＜0.05),lymph node metastasis(P＜0.05).The proportion of poor differentiation,stageⅢ～Ⅳ,lymph node metastasis in Id2 positive expression patients was significantly higher than those in negative expression patients(P＜0.05).The median survival time of disease progression in Id2 positive patients (24.7 months)was significantly lower than that in Id2 negative patients(38.5 months),P＜0.05.ConclusionId2 may play an important role in the development of colorectal cancer,which could be a biomarker for prognosis.

Colorectal cancer;Inhibitor of differentiation 2(Id2);Immunohistochemistry;Clinical characteristics;Survival time

R735

A

1003—6350（2016）14—2246—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.004

2016-01-12)

四川省德陽市2014年度重點科學技術(shù)研究項目（編號：2014SZ100-2）

韓蕓。E-mail：huanyun_sf@sina.com